重金屬鎘對於術種子萌發及其生理指標的影響

周海珺，杜佳鑫，杜向標，白巖

（1.浙江省龍泉市城區林業工作站，浙江 龍泉 323700；2.浙江省龍泉市劍池街道辦事處，浙江 龍泉 323700；3.浙江農林大學 食品與健康學院，浙江省特色中藥資源保護與創新利用重點實驗室，浙江 杭州 311300）

白術Atractylodes macrocephala屬菊科Compositae 蒼術屬Atractylodes多年生草本植物[1]，以根莖入藥，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等。現代研究表明，白術含有蒼術酮、蒼術醇、白術內酯等主要成分[2]，具有調節免疫[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老、抗炎、抑菌、擴張血管、降血糖等藥理作用[5]。其中，產于浙江臨安於潛的白術被稱為於術A.macrocephala‘Yuzhu’，亦名于術，品質優異，藥效顯著，為道地藥材。

重金屬Cd 直接影響植物的生理生化和生長發育，具有明顯的劑量效應。當Cd2+超過一定濃度后，對葉綠素有破壞作用，并促進抗壞血酸分解，使游離脯氨酸積累，抑制硝酸還原酶活性[6]。進入植物體的Cd2+常會改變細胞膜透性[7]，對葉綠體、線粒體、細胞核等亞顯微結構都有一定程度的破壞作用[8]，并且競爭性地取代某些酶活性中心的金屬元素而影響酶的正常活性，從而引起植物光合作用、呼吸作用、氮素代謝、核酸代謝等一系列生理過程的紊亂[9]。目前，國內外對重金屬如何危害蔬菜糧食作物的研究較多，有關重金屬Cd 如何影響中草藥的研究很少，因而本研究可以豐富Cd2+脅迫中草藥的相關研究內容。臨安地處江南，酸雨較多，促進當地紅壤中的Cd2+釋放；同時，於術以種子進行繁殖，并且沒有休眠習性，發芽較容易，因而容易受到土壤和水體中的Cd2+污染，影響其發芽和生理指標，進而影響其藥材的品質和質量。本研究設置Cd2+不同濃度梯度，考察其對於術種子萌發及其生理指標的影響，以期為於術安全生產以及藥材質量安全控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本研究所用於術種子來源于浙江臨安童家村於術種植基地。試驗所用材料CdCl2、KNO3、NaNO2、Na2HPO4·12H2O、對羥基苯磺酸、冰乙酸、鹽酸、H2O2、三氯乙酸、無水醋酸鈉、蒽酮、考馬斯亮藍、牛血清蛋白、葡萄糖、0.4% TTC、鄰甲氧基苯酚、乙酸乙酯、濃H2SO4、保險粉、無水乙醇、甲萘胺均購自浙江華東醫藥有限公司，除甲萘胺為化學純，其余均為分析純。

實驗所用儀器有紫外分光光計（上海恒平752 型）、電子天平（北京賽多利斯XPR204S/AC 型）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅DHG-9053A 型）、電熱恒溫培養箱（黃石恒豐SKP-02B 型）、臺式低速離心機（瑞沃德M-F24 型）、電子恒溫水浴鍋（北京光明HH-8 型）、游標卡尺（霍夫曼TESA-CALIP67）。

1.2 試驗方法

用去離子水將CdCl2配制成100 mg·L-1的母液，然后依次稀釋成0.1、1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0 mg·L-1（以Cd2+計）溶液。將大小均勻一致、籽粒飽滿、無病蟲害的於術種子消毒后，等量分成8 份，其中7 份種子分別用配置好的7 種濃度Cd2+溶液浸種（加試液用量約為種子量的3 倍），1 份以清水浸種（0 mg·L-1）為對照，共計8 個處理。浸種10 h 后，在培養皿內放兩層濾紙，用相應濃度的Cd2+溶液充分潤濕，將種子平鋪于濾紙上，每個培養皿放置50 粒於術種子，加蓋后，室溫下催芽并每天向培養皿中加入相應濃度的溶液，使濾紙保持濕潤。每個處理設置3 個培養皿，即3 次重復，取平均值作為試驗數據。

浸種后催芽3 d，當於術種子種胚突破種皮時調查發芽勢，以萌動種子數量占處理種子總數量的百分率表示。浸種6 d 后，當胚根與種子等長或胚芽長到種子長度的一半時，調查發芽率，以發芽種子占處理種子的百分率表示。出芽3～ 5 d 時，隨機取出已發芽於術種子50 粒，測量根長和芽長。采用TTC 比色法、磺胺比色法、蒽酮比色法、考馬斯亮藍G250法分別測定根的活力、硝酸還原酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量[8]。

1.3 數據分析

試驗數據通過SPSS 22.0 和Origin 軟件進行方差分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 Cd 2+濃度對於術種子萌發的影響

Cd2+濃度對於術種子萌發的影響見圖1。由圖1 可知，於術種子的發芽勢和發芽率均隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。對照於術種子的發芽勢和發芽率分別為55.12%和65.01%。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術種子的發芽勢和發芽率隨之升高。當Cd2+濃度為10.0 mg·L-1時，於術種子的發芽勢和發芽率均升至最大值，分別為66.91%和77.53%，分別比對照提高了20.12%和19.27%。當Cd2+濃度繼續增大時，於術種子的發芽勢和發芽率隨之下降，當Cd2+濃度增大至100.0 mg·L-1時，於術種子的發芽勢和發芽率降至最低，分別為41.81%和49.19%，分別比對照降低了24.14%和24.33%，抑制效果顯著。

圖1 Cd2+濃度對於術種子萌發的影響Figure 1 Effect of different concentration of Cd2+ on seed germination of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.2 Cd 2+濃度對於術種子芽長和幼根的影響

Cd2+濃度對於術種子芽長和幼根的影響見圖2。由圖可知，於術種子的芽長和根長均隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。對照於術種子的芽長和根長分別為0.75 cm 和3.25 cm。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術種子的芽長和根長隨之升高，當Cd2+濃度為10.0 mg·L-1時，於術種子的芽長和根長升至最大值，分別為1.35 cm 和4.66 cm，分別比對照提高了79.73%和35.44%。當Cd2+濃度繼續增大時，於術種子的芽長和根長隨之下降，當Cd2+濃度增大至100.0 mg·L-1時，於術種子的芽長和根長降至最低值，分別為0.52 cm 和2.48 cm，分別比對照降低了31.08%和23.42%，與各處理均差異顯著（P＜0.05）。

圖2 Cd2+濃度對於術種子芽長和根長的影響Figure 2 Effect of different concentration of Cd2+ on length of bud and root of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.3 Cd 2+濃度對於術種子根系活力的影響

Cd2+濃度對於術種子根系活力的影響見圖3。由圖3 可知，於術種子的根系活力隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。對照於術的根系活力為36.01 μg·根-1·h-1。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術種子的根系活力隨之升高，當Cd2+濃度為10.0 mg·L-1時，於術種子的根系活力最強，為84.62 μg·根-1·h-1，比對照提高了2.35倍。當Cd2+濃度繼續增大時，於術種子的根系活力開始下降。當Cd2+濃度增大至100.0 mg·L-1時，於術的根系活力降至最低值，為28.41 μg·根-1·h-1，比對照下降了21.14%。

圖3 Cd2+濃度對於術種子根系活力的影響Figure 3 Effect of different concentration of Cd2+ on root activity of A.macrocephala cv.Yuzhu

2.4 Cd 2+濃度對於術種子硝酸還原酶含量、可溶性總糖含量、可溶性蛋白含量的影響

2.4.1 對硝酸還原酶含量的影響 Cd2+濃度對於術種子硝酸還原酶含量的影響見圖4。由圖4 可知，於術種子的硝酸還原酶含量隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。對照於術種子的硝酸還原酶含量為1.48 μg·g-1·h-1。此后，隨著Cd2+濃度的增加，於術種子的硝酸還原酶含量也隨之升高，當Cd2+濃度達到10.0 mg·L-1時，於術種子的硝酸還原酶含量達到最大值，為3.12 μg·g-1·h-1，比對照提高了2.11 倍，與對照和其他處理間均差異顯著（P＜0.05）。當Cd2+濃度繼續增大時，於術種子的硝酸還原酶含量開始下降。當Cd2+濃度達到100.0 mg·L-1時，於術種子的硝酸還原酶含量達到最小值，為1.21 μg·g-1·h-1，比對照下降了17.92%。

圖4 Cd2+濃度對於術種子硝酸還原酶的影響Figure 4 Effect of different concentration of Cd2+ on nitrate reductase of A.macrocephala ‘Yuzhu’ seed

2.4.2 對可溶性糖含量的影響 Cd2+濃度對於術種子可溶性糖含量的影響見圖5。由圖5 可知，於術種子中的可溶性糖含量隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。對照於術種子的可溶性糖含量為11.82 μg·g-1。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術種子的可溶性糖含量也隨之升高，當Cd2+濃度達到10.0 mg·L-1時，於術種子的可溶性糖含量達到最大值，為16.56 μg·g-1，比對照提高了40.09%。當Cd2+濃度繼續增大時，於術種子的可溶性糖含量開始下降。當Cd2+濃度濃度達到100.0 mg·L-1時，於術種子的可溶性糖含量達到最小值，為7.82 μg·g-1，比對照下降了33.89%。

圖5 Cd2+濃度對於術種子可溶性糖含量的影響Figure 5 Effect of different concentration of Cd2+ on soluble sugar content of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.4.3 對可溶性蛋白含量的影響 Cd2+濃度對於術種子可溶性蛋白含量的影響見圖6。由圖6 可知，於術種子的可溶性蛋白含量隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。對照於術種子的可溶性蛋白含量為16.67 μg·g-1。此后隨著Cd2+濃度的增大，於術種子的可溶性蛋白含量也隨之升高，當Cd2+濃度達到10.0 mg·L-1時，於術種子的可溶性蛋白含量達到最大值，為33.58 μg·g-1，比對照提高了2.01 倍。當Cd2+濃度繼續增大時，於術種子的可溶性蛋白含量開始下降。當濃度達到100.0 mg·L-1時，於術種子可溶性蛋白含量降至最小值，為13.69 μg·g-1，比對照下降了17.87%。

圖6 Cd2+濃度對於術種子可溶性蛋白含量的影響Figure 6 Effect of different concentration of Cd2+ on soluble protein content of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.5 Cd 2+濃度對於術種子影響的相關性分析

Cd2+濃度與於術種子萌發及生化指標的相關性如表1。由表1 可知，Cd2+濃度與所有於術種子發芽和生長指標之間均存在負相關性，相關系數在-0.873 78～ -0.447 61 之間；發芽勢、發芽率、芽長、幼根長、根系活力、硝酸還原酶含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量之間均為正相關，其中根長和發芽勢、發芽率、可溶性糖含量之間呈極顯著相關(P＜0.01)，與芽長顯著相關（P＜0.05）。

表1 Cd2+濃度與於術種子萌發及各生理指標的相關性Table 1 Correlation analysis of Cd2+ concentration with seed germination and physiological traits of A.macrocephala ‘Yuzhu’

3 討論與結論

Cd 是一種生物非必需的重金屬元素，由于具有高毒性且在水體中較為穩定，是主要的重金屬污染物之一。本研究結果表明Cd2+對於術種子萌發及其生理指標的影響具有明顯的劑量效應，即低濃度Cd2+（≤10.0 mg·L-1，下同）對於術種子的發芽勢、芽和幼根長度、根活力、硝酸還原酶含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量具有一定的促進作用，而高濃度Cd2+（20～100 mg·L-1）則對其具有較為顯著的抑制作用。這與白嵩[10]以水稻Oryza sativa、張玲[11]和江虎生[12]等以小麥Triticum aestivum、付世景[13]以板藍根Isatis tinctoria為試驗材料的研究結果基本一致，均表現出了“低促高抑”的規律。

硝酸還原酶[14-15]是一種氧化還原酶，位于細胞質內或細胞膜外，在硝酸鹽還原途徑中是限速因子，可通過NADH 和NADPH 其中之一或兩者(雙功能) 提供兩個電子催化反應，催化硝酸離子還原成亞硝酸離子的反應，植物生長發育過程中的重要生理生化指標。可溶性糖[15-16]主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等，是參與植物生長發育的重要物質，也在遭遇到逆境脅迫時起到滲透調節作用，并在維持植物蛋白質穩定方面起到重要作用。植物體內的可溶性蛋白質大多數是參與各種代謝的酶類，是一個重要的生理生化指標，可以指征植物體總代謝水平和活躍度。皮爾森（Pearson）分析結果說明，隨著Cd2+濃度的增加，以上幾個生長和代謝指標受到的抑制均越來越顯著，同時和於術種子的發芽能力呈高度正相關。

Cd 作為環境污染中最為危險的因子之一，常常存在于水體、土壤或肥料中，通過進入植物體內并不斷積累，尤其是富集魚根部較多，可以進一步引發人類的多種疾病。但是應該注意的是，盡管多項研究顯示低濃度Cd2+可以提升多種植物種子的發芽狀況和早期生長指標，但是伴隨植物的生長及富集，植物就會出現各種毒害的癥狀，從而影響正常額生長發育，并將影響產量和品質，同時成為有毒的農產品及原藥材。

本研究結果揭示了Cd2+濃度對於術種子的發芽影響具有“低促高抑”的規律，探討種子萌發期間對Cd2+濃度的反應，所得數據可為於術安全生產以及於術藥材質量安全控制提供科學依據。相關Cd2+濃度影響於術的根莖膨大及品質形成的研究，將在下一步研究中揭示，并為於術藥材質量安全控制提供參考。