人參皂苷Rg3抗肝癌作用研究進展

唐琳琳 李洪英 劉文山 丁傳華

濰坊醫學院附屬醫院藥學部，濰坊 261031

2018年GLOBOCAN 數據顯示，全球肝癌發病率位居惡性腫瘤第6 位，病死率位居惡性腫瘤第2 位［1］。中晚期肝癌患者中位生存期短，對化療藥物耐藥性高，推薦中醫中藥輔助肝癌的治療［2］。人參皂苷Rg3（Ginsenoside Rg3，GRg3）是從五加科植物人參、西洋參、三七等根莖、莖葉提取的天然產物［3］，具有抗腫瘤、逆轉腫瘤靶向藥物耐藥等活性，對常見惡性腫瘤肺癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌均有抑制作用［4］。2003年以GRg3單體為主要成分的抗癌新藥參一膠囊上市，應用于肺癌、肝癌的輔助治療。本文主要闡述GRg3治療肝癌的臨床前及臨床研究進展，以期對后續研究提供參考。

GRg3的來源

1983年日本學者從朝鮮紅參中第1 次分離得到GRg3，它是一種四環三萜達瑪烷型稀有人參皂苷，在人參、西洋參、三七根和根莖中含量較少，在陳年參、人參莖葉、炮制的紅參及黑參中含量較高。按化學結構分類屬于原人參二醇型皂苷，結構式為C42H72O13，相對分子質量為784。天然人參皂苷Rb1、Rb2和Rd經過加熱、酶解可轉化為GRg3［5］。由于C20 位空間結構不同，GRg3 存在兩種對映體，即20（S）和20（R）異構體。20（S）-Rg（3）和20（R）-Rg3 三級結構的差異，導致20（S）-Rg3 抗腫瘤活性優于20（R）-Rg3［6］。與20（R）-Rg3 相比，20（S）-Rg3 可明顯抑制HepG2 細胞增殖及凋亡［7-8］。20（S）-Rg3苷元部分的烯烴鏈在C20附近產生緊密的疏水堆積，促進了其與Ca2+、Na+離子通道和幾種配體門控離子通道間的氫鍵結合，使其與離子通道受體區相互作用更強［9］。

GRg3抗肝癌作用研究

1、GRg3抗肝癌作用臨床前研究

1.1、體外實驗 體外實驗顯示，GRg3 可抑制多種肝癌細胞的生長，包括Hep3B、SMMC-7721、HepG2、Bel-7402、HCCLM3、SK-Hep1、SMC-7721、MHCC-97 細胞，抑制作用呈濃度依賴性和劑量依賴性［10-17］。

1.2、體內實驗 體內研究顯示GRg3 能顯著抑制肝癌細胞荷瘤小鼠腫瘤的生長［12-14］。Sun等［12］在體內實驗證實，GRg3 可顯著抑制HepG2 和MHCC-97L 在BABL∕c 裸鼠體內的生長。將肝癌細胞Hep1-6 植入小鼠肝臟構建原位肝癌模型。口服GRg3（10 mg·kg-1·d-1，連續30 d）顯著降低原位肝癌的生長，提高荷瘤小鼠的存活率和存活時間［13］。另一項體內實驗顯示，20（R）-Rg3 比20（S）-Rg3 對H22 移植瘤生長的抑制率更顯著，抑制率分別為40.9%和23.6%。GRg3 可通過刺激小鼠淋巴細胞增殖及升高白細胞介素-2 和干擾素-γ 水平顯著增強H22 荷瘤小鼠的細胞免疫功能［14］。

GRg3 增敏化療藥物抗癌效果。肝癌中位生存期較短，對化療藥物耐藥性高。研究表明，GRg3、奧沙利鉑單藥或兩藥聯合均能有效抑制肝癌細胞SMMC-7721的增殖，促進其凋亡，兩藥聯合組效果比單藥組更顯著［15］。體外實驗顯示GRg3 通過抑制自噬通量增敏阿霉素誘導的肝癌細胞死亡。體內實驗，證實GRg3 與阿霉素聯合用藥可顯著抑制Huh-7 細胞移植裸鼠腫瘤體積［16］。Jiang 等［17］研究發現，GRg3 以劑量和時間依賴性方式抑制肝癌細胞Hep1-6 和HepG2 的活力。用荷瘤C57BL∕6 小鼠做生存實驗，與對照組比較，GRg3、環磷酰胺、GRg3+環磷酰胺實驗組腫瘤生長速度延遲，明顯延長荷瘤小鼠的生存時間。腫瘤HE染色顯示，對照組腫瘤呈浸潤生長，血流豐富，實驗組肝細胞染色質固縮、凝集，失去血供。

1.3、GRg3聯合肝動脈栓塞技術可顯著改善療效 經動脈栓塞術（transcatheter arterial embolization，TAE）是一種用栓塞劑堵塞肝腫瘤供血動脈的微創技術［18］。肝細胞癌經TAE 治療可阻斷肝癌動脈血供，促進肝癌組織的壞死、缺氧，進而誘導肝癌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）上調和血管生成增加［19］。構建肝細胞癌大鼠原位移植模型，分為對照組、GRg3、TAE 組、GRg3+TAE 組。GRg3+TAE 組治療8周后，腫瘤長徑明顯短于對照組。GRg3+TAE 組和GRg3 組肝內和腹腔轉移率明顯低于對照組。GRg3+TAE 組總生存率優于TAE 組，微血管密度顯著低于TAE 組。GRg3+TAE 組VEGF 和VEGF 受體表達明顯減少，GRg3+TAE 治療通過下調VEGF 的表達抑制肝癌遠處轉移，延長大鼠生存期［20］。

一項研究觀察TAE 聯合肝動脈給藥GRg3 治療兔VX2肝腫瘤效果。結果顯示，肝動脈給藥增加GRg3局部濃度，TAE 聯合GRg3組平均腫瘤體積和生長速率明顯低于對照組。GRg3 可抑制腫瘤缺血缺氧引起的血管生成活性，誘導VX2 肝腫瘤細胞凋亡，是一種安全有效的治療兔VX2 肝腫瘤的方法［21］。

1.4、GRg3特殊制劑抗肝癌作用研究 GRg3在水中溶解度小，生物利用度低，限制了其在臨床的應用。為改善GRg3溶解度，增加抗腫瘤活性，針對GRg3的特殊制劑研究越來越多，如納米制劑、脂質體等［22-24］。制備GRg3-mPEG-PLLA（甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，mPEG-PLLA）共聚物載藥膠束，體內外實驗表明，該載藥膠束可顯著抑制肝癌HepG2 細胞生長及肝癌異種移植裸鼠腫瘤體積增加，提高了GRg3的溶解度及生物活性［25］。GRg3 與Fe@Fe3O4納米顆粒偶聯制備納米藥物，與GRg3相比，納米GRg3可顯著延長原位肝癌小鼠的生存時間，明顯減少肝臟表面腫瘤數量和腫瘤長徑、減少肝癌的肺轉移［22］。采用薄膜分散法制備Rg3 脂質體，包封率為82.47%。與GRg3 溶液相比，GRg3 脂質體組的峰值濃度（Cmax）和曲線下面積（AUC）分別增加1.19 倍和1.52 倍。GRg3 脂質體組對HepG2 細胞的細胞毒性和抑制率明顯高于GRg3組［24］。

2、GRg3（參一膠囊）抗肝癌的臨床研究

一項前瞻性臨床試驗，觀察肝癌合并門靜脈癌栓患者手術后，分別給予GRg3（一次20 mg，2 次∕d）、索拉非尼（每次400 mg，2 次∕d）口服，對遠期生存時間、術后腫瘤復發時間的影響。GRg3 組共31 人，索拉菲尼組共33 人，術后無瘤中位生存時間分別為8 個月和9 個月，差異無統計學意義；術后中位生存時間12 個月和14 個月，差異有統計學意義。GRg3 遠期抗腫瘤作用弱于索拉菲尼，建議肝癌合并門靜脈癌栓手術后服用索拉菲尼，經濟條件限制的患者建議口服GRg3［26］。

一項比較GRg3 聯合肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）和單獨TACE 治療晚期肝癌的有效性和安全性臨床試驗。228 例晚期肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者被隨機分配到兩個治療組。GRg3 聯合TACE 組的中位總生存期為13.2 個月，TACE 組為10.1 個月，中位進展時間分別為4.3 個月比3.2 個月（P=0.151），不可治療進展的中位時間分別為8.3 個月、7.3 個月（P=0.063）。GRg3 聯合TACE 組腫瘤控制率為69.7%，TACE 組為51.3%（P=0.012）。GRg3 緩解了一些與TACE 相關的不良綜合征和血液異常。在肝功能良好的晚期HCC 患者中，GRg3 聯合TACE 較單獨TACE 可延長患者的總生存期［27］。

GRg3抗肝癌的作用機制

1、誘導肝癌細胞凋亡

體內外研究表明，GRg3可誘導多種癌細胞凋亡［15，28-30］。Park等［10］研究發現GRg3明顯抑制Hep3B細胞增殖，促進凋亡。GRg3 通過升高細胞內活性氧（ROS）的水平，激活Bax蛋白，下調Bcl-2 蛋白表達，降低了線粒體膜電位，刺激Hep3B細胞線粒體細胞色素c的釋放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3 的激活，直接激活線粒體途徑誘導細胞凋亡。針對肝癌細胞SMMC-7721和HepG2細胞系研究中［31］，GRg3 給藥組的細胞增殖抑制率、凋亡率顯著高于對照組，并且細胞增殖抑制率、凋亡率隨著GRg3濃度和治療時間的增加而增加。機制方面，GRg3 組與對照組相比，肝癌細胞促調亡基因Bax 和caspase-3 的表達水平顯著增強，抗凋亡基因Bcl-2的表達水平顯著抑制，推測也是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。另一項研究發現，GRg3作用于HepG2細胞后觀察到細胞凋亡和線粒體腫脹和裂解，劑量依賴性方式下 調Bcl-2 和 上 調Fas［8］。GRg3 通 過 影 響 凋 亡 相 關 基 因Bcl-2-caspase9-caspase3 和PI3K∕AKT∕mTOR 信號通路誘導骨肉瘤細胞凋亡［32］。Zhang 等［28］研究發現，20（S）-Rg3 使膽囊癌細胞線粒體膜電位明顯降低，證明20（S）-Rg3 誘導膽囊癌細胞凋亡是通過線粒體途徑來發揮作用的。鈉氫交換蛋白-1（Na+∕H+exchanger1，NHE1）調節細胞間pH 值，在肝癌組織中呈現高表達，促進肝癌的惡化，抑制NHE1 可促進肝癌凋亡［33］。基于體內外研究，觀察到GRg3可以通過降低NHE1 表達抑制肝癌細胞Bel-7402、HCCLM3 增殖，誘導細胞凋亡。同時發現表皮生長因子可以上調NHE1 的表達，而GRg3 正是通過抑制EGF-EGFR-ERK1∕2-HIF-1α 途徑來降低NHE1的表達來誘導肝癌細胞凋亡［34］。

外源性凋亡途徑又稱為死亡受體途徑，20（S）-Rg3 對外源性途徑誘導的肝癌細胞調亡具有增敏作用。TRAIL 信號通路因對腫瘤細胞的選擇毒性，成為抗癌藥物研究的靶點，但耐藥性限制了TRAIL 的研發。研究 表明，20（S）-Rg3 通過上調DR5 的表達來敏化TRAIL 誘導 的 肝 癌 細 胞 凋 亡，包 括HepG2、SK-Hep1、Huh-7 和Hep3B，但對正常肝細胞HL-7702 生長無抑制作用。在小鼠異種移植模型中，20（S）-Rg3 與TRAIL 聯用可通過凋亡途徑，顯著抑制Huh-7 細胞荷瘤裸鼠腫瘤的生長，聯合應用抑制TRAIL耐藥［35］。

2、GRg3與自噬的關系

一項研究表明，GRg3 通過ATG5 依賴性自噬途徑增加SK-Hep1 和HepG2 細胞LC3 II 蛋白水平。GRg3 抑制自噬晚期階段，導致自噬通量阻滯。阿霉素誘導的自噬具有促肝癌細胞生存作用，可引起肝癌細胞耐藥。體外研究發現，GRg3 與阿霉素聯用，可抑制自噬，克服化療耐藥性，增敏阿霉素誘導的肝癌細胞死亡。用小鼠異種移植模型也證實了GRg3 與 阿 霉 素 的 協 同 作 用［16］。Bian 等［36］研 究 發 現20（S）-Rg3 抑制饑餓狀態下的細胞自噬，使細胞無法通過自噬維持穩定狀態，進而誘導凋亡。20（S）-GRg3阻斷自噬晚期的溶酶體融合和自噬溶酶體降解，使自噬和凋亡之間失去平衡，導致細胞凋亡。另一項研究卻發現20（S）-GRg 3 觸發HepG2 細胞自噬，觀察到自噬空泡及自噬溶酶體產生增加［8］。

3、GRg3抑制肝癌細胞侵襲轉移、黏附

大量研究表明，GRg3 能顯著抑制肝癌細胞侵襲、轉移和黏附。作為Rho 信號負調控因子，Rho GTPase激活蛋白9（ARHGAP9）在肝癌中表達下調。研究表明，GRg3 能顯著降低肝癌細胞HepG2 和MHCC-97L 的侵襲和遷移能力，抑制HepG2和MHCC-97L在BABL∕c裸鼠體內的生長。經GRg3 處理后，這兩種肝癌細胞中ARHGAP9 蛋白表達增加。ARHGAP9 基因敲除后，GRg3 的抗肝癌細胞侵襲、遷移和抗腫瘤生長作用明顯受損，GRg3 誘導的ARHGAP9 蛋白表達增加明顯受到抑制。結果提示ARHGAP9 蛋白可能是GRg3 抗侵襲轉移作用的重要調節 因 子［12］。Mao 等［37］發現GRg3 能通過下調基質金屬蛋白酶（MMP）2∕MMP7∕MMP9、抑制上皮間質轉化（EMT）以及Wnt∕β-catenin 蛋白表達抑制癌細胞的遷移和侵襲。Liu 等［38］研究發現，20（S）-Rg3 上調脯氨酰羥化酶結構域蛋白1，促進缺氧誘導因子1α 泛素蛋白酶體在正常氧水平下的降解，降低缺氧誘導因子1α 的表達，從而在體外和體內發揮抑制癌細胞遷移作用。

4、GRg3抑制血管生成

將小鼠肝癌細胞Hep1-6植入小鼠肝臟，構建肝原位癌模型，小鼠口服GRg3（10 mg∕kg，1 次∕d，連續30 d），通過CD105 染色血管計數測定腫瘤血管生成定量（MVD）。GRg3 組腫瘤血管MVD-CD105 陽性染色明顯少于對照組［13］。另一肝癌大鼠模型結果顯示，GRg3聯合TAE 降低肝癌大鼠模型中血管生成及VEGF、CD31、VEGFR2 的表達［20］。在兔VX2 肝癌模型中，GRg3 聯合TAE 組表達的CD31 和VEGF 水平顯著降低。體外實驗，GRg3 顯著下調HepG2 細胞VEGF 表達。結果表明，GRg3 聯合TAE 可通過抑制腫瘤血管生成而有效抑制腫瘤生長［21］。大量研究表明，GRg3 通過抑制VEGF、VEGFR 表達劑量依賴性抑制人臍靜脈內皮細胞、內皮祖細胞管型形成及微血管出芽［39］。

結 論

GRg3 體內外實驗研究及參一膠囊的臨床應用均證明其有良好的抗肝癌活性。GRg3 抗肝癌的作用機制是多方面的，包括誘導肝癌細胞凋亡、調控自噬逆轉耐藥、抑制細胞侵襲及轉移、抑制血管生成等。但對GRg3抗肝癌的作用機制有待進一步深入研究，新的制劑形式也有待進一步開發以發揮抗肝癌作用，延長晚期肝癌患者的生存期。