番茄根際禾谷鐮刀菌拮抗細(xì)菌的鑒定及功能特性

何宏濤，王玉虎，周洪友，劉 穎，趙明敏，鄭紅麗

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 012000)

馬鈴薯為我國四大糧食作物之一，栽培面積居世界首位，隨著栽培面積的不斷增加，導(dǎo)致馬鈴薯土傳病害加重。馬鈴薯枯萎病是由鐮刀菌(Fusarium)引起的一類真菌性土傳病害[1]，全國各地普遍發(fā)生，重茬地更為嚴(yán)重且病菌復(fù)雜，遺傳變異性強(qiáng)，防治難度大，嚴(yán)重時導(dǎo)致馬鈴薯整株枯死，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，嚴(yán)重影響我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

近年來，化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用[2]，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、食品安全風(fēng)險等問題日益突出，隨著我國對糧食安全生產(chǎn)的重視，生物防治成為如今倡導(dǎo)的主題，因此，不斷開發(fā)環(huán)境友好型的安全并兼?zhèn)鋬?yōu)良防治效果的生物農(nóng)藥具有重要意義。已有學(xué)者大量篩選出具有明顯拮抗馬鈴薯枯萎病鐮刀菌及其他病害的拮抗細(xì)菌，如王莉等以解淀粉芽孢桿菌DS-1生防菌為研究對象，通過粉劑和粒劑處理植物，發(fā)現(xiàn)均能提高番茄和黃瓜的株高和鮮質(zhì)量并對辣椒枯萎病的田間防效可達(dá)60.75%、62.86%[3]。許帥等從馬鈴薯根際土壤分離到一株具有明顯抑制馬鈴薯枯萎病的生防細(xì)菌，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)[4]。李彩虹等從不同地區(qū)的馬鈴薯根際土壤篩選到6株對馬鈴薯枯萎病菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)拮抗作用較強(qiáng)的芽孢桿菌[5]。王飛從香蕉根際226株固氮菌、95株放線菌中進(jìn)一步篩選出對香蕉枯萎病具有抑制作用的2株固氮細(xì)菌、1株放線細(xì)菌[6]。本試驗篩選到一株具有固氮、解磷同時具有拮抗馬鈴薯枯萎病的生防細(xì)菌，以期為馬鈴薯枯萎病病原菌的生物防治提供菌源和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 番茄植株及土壤樣品于2021年4月21日采自內(nèi)蒙古呼和浩特市賀新草莓園(40.663 199°N，111.775 257°E)番茄大田。番茄植株生育期為坐果期，無病蟲害且生長健壯。

1.1.2 所需培養(yǎng)基 主要培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[7]、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、阿須貝[8]培養(yǎng)基、蒙金娜無機(jī)磷[9]培養(yǎng)基、有機(jī)磷卵磷脂培養(yǎng)基、磷礦粉[10]培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基[11]、幾丁質(zhì)酶篩選培養(yǎng)基[12]，培養(yǎng)基配方詳見上述參考文獻(xiàn)。

膠體幾丁質(zhì)的制備：參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行膠體幾丁質(zhì)的制備。

1.1.3 供試病原真菌 試驗所用病原真菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄細(xì)菌的分離 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化[14-15]：新鮮的植物根、莖、葉組織清洗干凈后，晾干，在無菌操作臺依次采用75%乙醇、1%次氯酸鈉各2 min進(jìn)行表面消毒，無菌水反復(fù)重新洗3～5次，將根、莖、葉分別剪成小塊稱取1 g，在無菌研缽中加入1 mL無菌水充分研磨后加入到8 mL無菌水中180 r/min充分振蕩30 min制成菌懸液母液，稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4進(jìn)行LB培養(yǎng)基涂布，每板50 μL，每個梯度3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，根據(jù)菌的外觀、形態(tài)、色澤，凹凸等特點(diǎn)挑取單菌落，在LB培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)，重復(fù)直至獲得單菌落。

根際土壤細(xì)菌的分離：稱取5 g土樣于三角瓶中，加入45 mL水，28 ℃ 160 r/min振蕩30 min，靜置10 min，即土壤懸浮液母液，分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，選取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液涂布于LB培養(yǎng)基上，每板50 μL，每個梯度3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出在LB培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)，所有分離得到的番茄根莖葉以及土壤中的細(xì)菌用50%甘油保存。

1.2.2 拮抗能力研究 以分離到的85株細(xì)菌為供試菌株，測定細(xì)菌對禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的抑制活性，采用五點(diǎn)對峙法[16]初篩：將供試病原真菌活化，打3 mm菌餅接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中央，周圍點(diǎn)接4株待測細(xì)菌，28 ℃培養(yǎng)，每天觀察記錄，是否產(chǎn)生抑菌圈，可初步確定具有拮抗能力的菌株。

采用兩點(diǎn)對峙法復(fù)篩，將供試病原真菌菌餅接于培養(yǎng)基中點(diǎn)左側(cè)2 cm處，初篩得到的所具有拮抗能力的菌株點(diǎn)接于中點(diǎn)右側(cè)2 cm處，每株菌3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5 d，測定抑菌帶寬度及計算抑菌率。

FQD25和FQC7發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的抑制活性[17]：將上述2株拮抗菌株接種LB培養(yǎng)基搖床振蕩培養(yǎng)測定D600 nm≈0.6，吸取上述菌液2 mL接種于100 mL LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，0.22 μm細(xì)菌過濾器抽濾滅菌，PDA固體培養(yǎng)基與細(xì)菌發(fā)酵液10 ∶1制成含有發(fā)酵液平板，每個處理3個重復(fù)，0.5 mm打孔器制作上述病原真菌菌餅，接種于PDA平板中央，2、3、4、5 d觀察，十字交叉法測量菌落直徑并記錄。

測定菌株FQD25發(fā)酵液對其他病原真菌的抑菌活性。

1.2.3 菌株FQD25形態(tài)鑒定及生理生化鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]對菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括V.P試驗、檸檬酸鹽、丙酸鹽、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解、革蘭氏染色等10項試驗，并進(jìn)行菌株FQD25的形態(tài)觀察。

1.2.4 菌株FQD25的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 細(xì)菌全基因組序列提取試劑盒提取細(xì)菌DNA后，采用細(xì)菌通用引物7F-1540R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL)為：0.125 μL r-Taq、2 μL dNTP、2.5 μL 10×buffer、引物各1μL、DNA模板1 μL、ddH2O補(bǔ)足，反應(yīng)程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 40 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。送去北京六合華大基因科技有限公司測序后得到拼接序列，通過與BLAST數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 菌株FQD25特性研究 以FQD25為供試菌株采用不同篩選培養(yǎng)基測定菌株的固氮、解磷、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力、產(chǎn)蛋白酶能力及對7種抗生素的耐藥性(表1)。

1.2.6 菌株FQD25抑菌物質(zhì)的初步研究 禾谷鐮刀菌、茄匍柄霉(Stemphyliumlycopersic)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)為供試病原菌，以硫酸銨沉淀法提取菌株FQD25抑菌物質(zhì)，分別以30%、50%、70%硫酸銨加入到無菌發(fā)酵濾液中，混合后放入 4 ℃ 冰箱沉淀24 h，取出后12 000 r/min離心，收集不同飽和度下沉淀并加入1 mL 50 mmol/L的pH值為6.8的PBS中溶解備用，在PDA培養(yǎng)基上吸取上述液體30 μL打在培養(yǎng)基中央，打取病原菌菌餅接種于上述液體上，測定不同飽和度下提取物對病原菌菌落大小的影響，以打無菌清水為對照，每個處理3個重復(fù)，計算菌落大小差異。

1.2.7 生防菌株FQD25對溫室盆栽馬鈴薯枯萎病病菌的防治效果 以FQD25為供試菌株，采用溫室馬鈴薯盆栽法研究生防菌株對馬鈴薯枯萎病的防治效果，將薯塊播種于無菌基質(zhì)土中，30 d后分為3個處理組，每組20個重復(fù)。采用灌根法以菌株FQD25發(fā)酵液澆灌盆栽馬鈴薯根際土壤，每株 30 mL，隔48 h再進(jìn)行1次澆灌，以多菌靈1 500倍液為陽性對照，以清水為陰性對照(CK)，于最后1次處理間隔24 h后接種鐮刀菌包子懸液30 mL，待陽性對照表現(xiàn)明顯癥狀后觀察盆栽馬鈴薯發(fā)病情況，參考馬鈴薯枯萎病病情分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查，計算病情指數(shù)。病情指數(shù)=100×∑(各級病株數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值)，防效=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%，馬鈴薯盆栽病情分級標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[19]。

孢子懸浮液制備：病原真菌接種于PDB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，無菌紗布過濾掉菌絲，血球計數(shù)板觀察計算孢子數(shù)為106～107CFU/mL備用。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 單因素方差分析采用SPSS 20.0(α=0.05)，用GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株抑菌作用研究

以分離到的85株細(xì)菌為供試菌株，通過初篩和復(fù)篩，共獲得6株可以拮抗馬鈴薯枯萎病禾谷鐮刀菌的拮抗菌株，占總株數(shù)的7%：FAC7、FQD25、FAD56、FQA7、FQD39、FQD36用作后續(xù)試驗(圖1、圖2)。

FQD25、FQC7上清液對禾谷鐮刀菌抑菌試驗的抑制效果為FQD25>FQC7，且從處理3 d開始2株細(xì)菌發(fā)酵液對病原真菌的抑制活性具有明顯差異(圖3)。菌株FQD25作為優(yōu)勢菌株用作后續(xù)研究。

以FQD25為供試菌株制備發(fā)酵液，測定其對4種病原真菌的抑制活性，結(jié)果表明，F(xiàn)QD25發(fā)酵液對4種病原真菌均具有不同程度的抑制作用，對茄匍柄霉菌的抑制效果最好，幾乎達(dá)到了100%，對短肥鐮刀菌(Fusariumbrachygibbosum)抑制效果不明顯，但經(jīng)菌株FQD25發(fā)酵液處理后，與對照相比菌落顏色有所變化，表面菌絲極少(圖4、表2)。

2.2 菌株FQD25形態(tài)鑒定及生理生化鑒定

菌株FQD25菌落表面光滑濕潤、圓形、菌落有褶皺、乳白色、中間凹陷。參照已發(fā)表文章中的鑒定菌株[20-21]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》選取部分生理生化指標(biāo)對菌株FQD25進(jìn)行測定比較，結(jié)果如表3所示，符合對芽孢桿菌的描述。

2.3 菌株FQD25 16SrDNA分子生物學(xué)鑒定

為進(jìn)一步明確菌株FQD25的分類地位，通過7F和1540R引物對其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增到的片段大小符合預(yù)期。通過測序后的序列比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株FQD25與貝萊斯芽孢桿菌親緣關(guān)系較近，并聚為一支(圖5)，結(jié)合形態(tài)鑒定及生理生化鑒定表明，菌株FQD25歸屬于貝萊斯芽孢桿菌。

表2 菌株FQD25發(fā)酵液對4種病原真菌的抑制活性

表3 菌株FQD25的生理生化鑒定

2.4 菌株FQD25的功能特性研究

通過不同篩選培養(yǎng)基，測定菌株FQD25固氮、解有機(jī)磷及無機(jī)磷、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、產(chǎn)蛋白酶及對7種抗生素的耐藥性(圖6)，結(jié)果表明，菌株FQD25在有機(jī)磷培養(yǎng)基(圖6-C)、無機(jī)磷磷礦粉培養(yǎng)基(圖6-E)及蛋白酶培養(yǎng)基上有透明圈出現(xiàn)(圖6-B)，但在膠體幾丁質(zhì)平板(圖6-A)和無機(jī)磷磷酸三鈣培養(yǎng)基(圖6-D)上沒有透明圈出現(xiàn)。7種抗生素抗性試驗表明，菌株對鏈霉素和四環(huán)素具有抗性。

2.5 菌株FQD25抑菌物質(zhì)初步研究

以不同飽和度硫酸銨沉淀菌株FQD25無菌發(fā)酵液蛋白，測定不同濃度下的硫酸銨提取物對3種不同病原真菌的抑制活性，結(jié)果表明，不同飽和度的蛋白粗提液對茄匍柄霉菌、禾谷鐮刀菌都具有抑制活性，對立枯絲核菌無抑制作用。在硫酸銨為50%飽和度時對尖孢鐮刀菌的抑制效果最好，70%硫酸銨飽和度下對茄匍柄霉菌抑制效果最佳(表4、圖7)。

表4 FQD25不同濃度硫酸銨提取抑菌物質(zhì)對病原菌菌落大小的影響

2.6 菌株FQD25對溫室盆栽馬鈴薯的防治作用

盆栽試驗結(jié)果表明，生防菌株FQD25對馬鈴薯的病情指數(shù)低于CK，CK的病情指數(shù)為85，接種生防菌株FQD25的病情指數(shù)為50，比CK減少了35，防治效果為41.17%，略高于多菌靈對馬鈴薯的防效(表5)。

表5 生防菌株FQD25對馬鈴薯枯萎病的防治效果

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌廣泛分布于自然界中，根據(jù)環(huán)境、宿主、土壤pH值等因素的不同，細(xì)菌種類也隨之變化[22-24]，近年來關(guān)于細(xì)菌代謝產(chǎn)物在動植物、食品以及抑制植物病害等方面已有大量報道，研究主要集中在食品工業(yè)、植物促生菌、拮抗病原菌、抑菌物質(zhì)鑒定及基因簇鑒定等方面[25-27]。Dong等從土壤中分離到9株對軟腐病具有良好防效的病原菌[28]，通過鑒定為蠟樣芽孢桿菌，田間試驗表明，菌株CAB-L022具有良好的生防效果。本研究通過兩點(diǎn)對峙法從番茄根際及番茄組織內(nèi)篩選到6株禾谷鐮刀菌拮抗細(xì)菌，選取其中2株通過發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的抑菌活性研究，結(jié)果表明FQD25抑菌效果優(yōu)于FQC7且對其他4種病原真菌均有不同程度的影響，以FQD25為供試菌株，進(jìn)一步采用不同飽和硫酸銨提取粗蛋白液進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果顯示對禾谷鐮刀菌在50%飽和度下抑菌效果最好，對于茄匍柄霉菌在70%飽和度下抑制效果最佳，對立枯絲核菌無抑制作用。經(jīng)生理生化鑒定及16S rDNA鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

目前，在平板上有作用的拮抗試驗在作用于盆栽試驗時，防治效果并不理想。程海洋等從矮火絨草根內(nèi)分離獲得6株生防菌，其中2株效果最好，發(fā)酵液抑菌率分別可達(dá)82.58%、83.21%，盆栽試驗中防治效果下降[29]。可能是因為其試驗環(huán)境以及溫度、pH值、植物材料本身的多方面因素影響所導(dǎo)致的。本研究通過發(fā)酵液對盆栽馬鈴薯防治枯萎病的試驗，結(jié)果表明：菌株FQD25的病情指數(shù)為50，比CK減少了35，防治效果為41.17%，與平板拮抗效果相似。