抗呋喃唑酮代謝物衍生物單鏈抗體-AP酶融合蛋白表達條件優化

王玉波，鄧煒杰，陳薪竹，王 丹，洪艷平，熊建華，戴 棚，楊武英

(1.南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室/江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌 330045；2.四川百利藥業有限責任公司，四川成都 610041)

傳統多克隆抗體和單克隆抗體的制備需從抗原、包被原的合成開始，其間會用到大量的化學試劑，對操作者的健康產生危害，而且還需要對動物進行免疫，細胞融合耗費較多的時間。基因工程方法把抗體的制備提高到新的高度，擺脫了傳統抗體制備的繁瑣和復雜，不需要通過細胞雜交，直接在分子水平進行研究，完善傳統抗體制備的方法，彌補其不足，提高并擴大了抗體的應用范圍[19-22]。單鏈抗體(scFv)是近年來流行的一種新型基因工程抗體，僅含抗體重鏈 (VH)和輕鏈(VL)，由一條單一肽鏈連接而成。scFv具有體積小、特異性和親和力高、免疫原性低、基因工程能力強等優點，且抗體生產周期短、成本低，可在細菌表達系統中進行快速大規模制備。因此，scFv近年在各個領域得到廣泛應用，尤其是在農獸藥殘留免疫檢測方面[23-26]。scFv可以與堿性磷酸酶(AP)偶聯形成融合蛋白，該蛋白具備scFv分子生物活性和AP酶活性，酶標二抗在檢測實際樣品時被刪減，有利于縮短試驗時間、節省成本，減少生物試劑對操作者健康的危害。

本研究室在前期工作中已經成功構建得到抗AOZ衍生物單鏈抗體(AOZscFv)基因，并把AOZscFv基因轉入到可溶性表達載體plip6/GN 中和堿性磷酸酶基因進行融合表達，但是發現表達量偏低[27]。本試驗首先測定抗AOZ衍生物scFv基因工程宿主菌生長曲線，然后經過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質免疫印跡(Western-blotting)分析鑒定后，通過探討5種培養基、6種誘導時間、4種IPTG(誘導劑-異丙基硫代半乳糖苷)濃度對融合蛋白表達的影響，來提高大腸桿菌中融合蛋白的表達量，然后利用NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱對該融合蛋白進行親和層析純化，采用直接競爭酶聯免疫分析法(dcELISA)檢測該融合蛋白的生物活性，為后期抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白大量生產和呋喃唑酮代謝物AOZ在動物性食品中殘留免疫快檢的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗時間為2021年3月，試驗地點為江西農業大學食品科學與工程學院農產品加工與質量控制重點實驗室。

試驗菌種：BL21(DE3)[BL21(DE3)是含有噬菌體T7 RNA 聚合酶溶原的BL21菌株，適用于含有依賴T7 RNA 聚合酶轉錄的啟動子的載體]購自北京全式金生物有限公司，抗AOZ衍生物scFv陽性基因工程宿主菌plip6/GN-scFv/BL21由本實驗室制備保存。

試劑：SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、凝膠蛋白質染色液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；蛋白Marker、2xSDS上樣緩沖液、誘導表達劑IPTG、PEG10000、5000DNA Marker(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白胨、酵母提取物均(英國OXOID公司)、NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱(GE公司)；底物溶液對硝基苯磷酸二鈉 (北京百靈威科技有限公司)。

主要儀器設備：智能生化培養箱、恒溫培養振蕩器、智能超凈工作臺(江蘇迅迪儀器科技有限公司)；蛋白電泳儀、酶標儀(美國BIO-RAD公司)、超微量核酸分析儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗AOZ衍生物scFv基因工程宿主菌生長曲線的測定 將本研究室構建并冷凍保存的抗AOZ衍生物scFv陽性基因工程宿主菌plip6/GN-scFv/BL21復蘇培養，按5%的接種量轉接至15 mL 剛剛配置好的含氨芐青霉素(Amp，100μg/mL)的LB 培養基(Luria-Bertani)中，每隔2 h測其D600 nm值，檢測至18 h即可，每次做3個平行試驗，計算數據并繪制生長曲線。

1.2.2 單鏈抗體的表達鑒定 復蘇培養的菌液，在50 mL LB-Amp培養基中轉接10%接種量，將培養基置于37 ℃下培養，直至600 nm波長處吸光度保持在0.6～0.8的范圍內，加入誘導劑(IPTG) 50 μL，使培養基最終濃度為0.6 mmol/L；再將培養基置于轉速為180 r/min、溫度為28 ℃的搖床上，培養7 h后，采用超聲對AOZscFv-AP融合蛋白進行提取[28]，最后，利用 SDS-PAGE和Western-blotting分析鑒定，同時設空載體為空白對照。

1.2.3 最適培養基的選擇 復蘇培養的菌液分別采用2×YT 培養基(2× YT medium)、TB 培養基(terrific broth)、SB 培養基(super broth)、LB 培養基、SOB 培養基(super optimal broth)5種培養基進行培養，然后分別加入誘導劑IPTG，以28 ℃、280 r/min 搖床培養7 h后，收集菌體，對表達的目的蛋白進行超聲提取，再通過SDS-PAGE蛋白質凝膠電泳查看不同培養基下抗體蛋白的表達情況。

1.2.4 誘導表達時間的選擇 復蘇培養的菌液，接種至上述優選出的最適培養基后進行搖床培養，加入誘導劑IPTG，再用28 ℃、280 r/min分別誘導5、6、7、8、9、10 h，收集菌體，對表達的目的蛋白進行超聲提取，再利用SDS-PAGE蛋白質凝膠電泳分析6種誘導時間下抗體蛋白的表達情況。

1.2.5 IPTG濃度的選擇 在上述優選出的最適培養基和最佳誘導表達時間下，在菌液中分別加入不同質量的誘導劑IPTG使其終濃度分別為0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L，用28 ℃、280 r/min誘導表達，收集菌體，對表達的目的蛋白進行超聲提取，通過 SDS-PAGE 蛋白質凝膠電泳查看不同IPTG濃度下抗體蛋白的表達情況。

1.2.6 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白的純化 用磷酸鹽緩沖液(PBS)將包被抗原AOZ-COOH-OVA稀釋至1 mg/mL，4 ℃冰箱備用。取 NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱填料1 mL加入到層析柱中，用0.1 mol/L HCl洗滌填料，然后加入稀釋好的抗原溶液，置于4 ℃冰箱過夜。次日收集抗原溶液，用 2 mL 封閉緩沖液封閉2 h，棄掉封閉緩沖液后，用緩沖液A和緩沖液B反復交替洗滌填料至少6次，隨后將填料儲存于PBS緩沖液中，備用。將處理好的純化柱取出，棄掉PBS后，加入濃縮的抗AOZ衍生物scFv融合蛋白超聲波破碎提取液進行親和吸附，用PBS反復平衡柱子，加入甘氨酸鹽酸(Gly-HCl)洗脫scFv蛋白，并立即用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)中和蛋白，使用聚乙二醇10000(PEG10000)濃縮，通過SDS-PAGE蛋白質凝膠電泳查看結果，并用超微量核酸分析儀測定純化后融合蛋白的濃度。

2 結果與分析

2.1 抗AOZ衍生物scFv基因工程宿主菌生長曲線的測定

將基因工程菌plip6/GN-scFv/BL21(DE3) 和對照菌株BL21(DE3) 復蘇、擴大培養后，每2 h于600 nm波長處測定其吸光度，以D600 nm值為縱坐標，培養時間為橫坐標繪制生長曲線，結果見圖1，培養0～16 h時，基因工程菌與對照菌的生長趨勢隨時間的延長而上升；16 h后，生長緩慢，且二者的生長趨勢基本一致。說明該外源基因沒有對宿主菌BL21(DE3) 的生長代謝帶來干擾和負擔，因此，宿主菌BL21(DE3)適合表達該外源基因。

2.2 單鏈抗體的表達鑒定

基因工程菌培養液加入IPTG后，采用超聲破碎法對誘導表達得到的AOZscFv-AP融合蛋白進行提取，并利用SDS-PAGE(A)和Western-blotting(B)對融合蛋白進行鑒定，結果見圖2。AOZ單鏈抗體蛋白和AP酶分子量范圍分別為20～30、50～60 ku，綜合2個分子量的范圍可以判斷出融合蛋白分子量在70 ku左右。在SDS-PAGE鑒定圖的泳道2處出現一條新生蛋白帶，約為55～72 ku，確定該條帶就是AOZscFv-AP融合蛋白，Western-blotting鑒定圖也在55～72 ku出現很明顯條帶，再次確定該條帶為AOZscFv-AP融合蛋白。

2.3 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在不同培養基中表達量的變化

在其他條件最適宜的情況下，菌體的生長和蛋白的表達均隨培養基發生改變受到一定程度的影響[29]，通常情況下，營養成分較高的培養基使細菌的生長更加快速。根據融合蛋白培養基對營養的需要，培養基必須既能提供微生物生長繁殖的外部生存環境，又能滿足細胞對營養和能量基礎物質的需求，因此，研究抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在5種培養基中表達量的變化，結果見圖3，經2×YT、TB、SB、LB、SOB培養的基因工程菌plip6/GN-scFv/BL21(DE3) 誘導和用Quantity one 4.6.6分析可知，5種培養基表達的蛋白量分別為3.06%、3.40%、4.33%、3.06%、3.77%，其中SB培養基表達的蛋白量最高，說明SB培養基更適合表達抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白。

2.4 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在不同誘導時間下表達量的變化

劉佳璐等研究表明，IPTG誘導劑可使蛋白質得到持續表達，且蛋白表達量直接受到IPTG誘導時間的影響，誘導時間不足會導致蛋白表達量偏少，表達時間過長則會產生不必要的經濟損失[30]。為了研究融合蛋白的表達量在不同誘導時間段下的變化，試驗設置6個誘導時間分析其表達量的不同。由圖4可知，隨著誘導時間的增加，蛋白表達量不斷上升，在9 h左右出現最高值，達到5.71%，在10 h其表達量出現下降趨勢。因此，抗AOZ衍生物 scFv-AP 融合蛋白表達的最佳誘導時間采用9 h。

2.5 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在不同濃度誘導劑下表達量的變化

由于IPTG具有一定的毒性，當其自身濃度過高時，會具有高毒性，破壞菌體的生長，同時也不利于操作者的健康與節約成本[31]。本試驗設置4個誘導劑濃度進行試驗。結果見圖5，當誘導劑IPTG濃度為0.6 mmol/L時，蛋白質的提取表達效果優于其他4個濃度，軟件Quantity one 4.6.6分析其蛋白表達量高達5.82%。因此，0.6 mmol/L的IPTG最適合誘導表達。

綜上所述，最適宜的條件為SB培養基，0.6 mmol/L IPTG，培養9 h。經軟件Quantity one V4.6.6分析得到該條帶的表達水平達5.75%，比表達條件優化前的表達量(2.89%)增加了約2.86百分點，有效提高了表達量[27]。

2.6 融合蛋白的純化

將樣品過純化柱后，用0.1 mol/L HCl進行洗脫，洗脫液通過PEG10000濃縮，再用SDS-PAGE分析。結果如圖6所示，經過NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱純化再濃縮后得到的抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白條帶單一、純度高，其融合蛋白的濃度為 1.973 mg/mL，表明該融合蛋白純化效果良好。

2.7 融合蛋白的活性鑒定

采用dcELISA的分析方法檢測“2.6”節中融合蛋白的活性，以NPAOZ標準溶液濃度梯度的對數為x軸，D/D0為y軸(在405 nm波長下，D表示標準藥物濃度梯度的吸光度，D0表示空白的吸光度)繪制標準曲線(圖7)。通過擬合計算得到50%抑制率(IC50)值為56.923 1 ng/mL。這說明在本試驗選取的表達條件下進行誘導表達得到的抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白具有較好的生物活性。

3 結論

抗呋喃唑酮代謝物衍生物scFv的基因工程菌plip6/GN-scFv/BL21(DE3) 和對照菌株BL21(DE3)生長曲線結果表明，外源scFv基因適合通過宿主菌BL21(DE3) 進行表達。前期工作中發現抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在大腸桿菌中的表達量偏低，僅為胞內可溶性表達，目的蛋白只存在于細胞周質腔空間中，培養基上清中未發現目的蛋白，須要采用超聲波破碎法才能從周質腔空間中釋放提取出目的蛋白，因此本研究提取目的蛋白時采用超聲波破碎法，有效優化了表達條件。通過對誘導表達并超聲波破碎法提取得到的抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白進行SDS-PAGE和Western-blotting鑒定可知，新生蛋白帶出現在55～72 ku之內，確定該條帶就是抗AOZscFv-AP融合蛋白。本試驗抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在5種培養基、6種誘導時間和4種IPTG濃度的條件下，對融合蛋白在大腸桿菌中胞內可溶性表達進行了優化，結果表明，最適宜的條件為SB培養基，0.6 mmol/L IPTG，培養9 h，該條件下抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白的表達效果較好，表達量從2.89%增加到5.75%，總體增加了約2.86百分點。本試驗采用NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱對提取得到的蛋白進行親和層析純化，純化后濃縮的融合蛋白的濃度為 1.973 mg/mL，同時dcELISA的 IC50值為 56.923 1 ng/mL，表明在最佳表達條件下得到的融合蛋白經純化后具有較好的生物活性，為后期抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白大量生產制備和呋喃唑酮代謝物AOZ在動物性食品中殘留免疫快檢的建立奠定基礎。