油菜矮稈相關基因定位克隆及其在育種中的應用

王小川,李 昕,閻晉東,張 慧,趙小英

(湖南大學生物學院植物功能基因組學與發育調控湖南省重點實驗室湖南省雜交油菜工程技術研究中心,中國湖南 長沙 410082)

油菜是一種重要的油料作物,其株高嚴重影響作物的抗倒能力、產量和機械化收割。甘藍型油菜倒伏導致種子重量下降11%,收獲指數下降3.3%[1]。同時,倒伏后的油菜難以收割,使損失更加嚴重。矮稈及半矮稈株型油菜品系選育有利于提高植株抗倒伏能力和收獲指數[2]。作物矮化大多與植物激素生物合成或信號轉導途徑有關,其中與赤霉素(gibberellin,GA)和油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)相關的研究較多,與生長素(auxin)相關的研究比較少[3]。在小麥和水稻中,研究人員已成功分離、克隆出矮稈基因并將其應用在育種中,取得了“綠色革命”的巨大成功[4～6]。目前,科研工作者已發現和創制了多個油菜矮稈材料,并對部分矮稈基因進行了定位克隆。本文就油菜矮稈相關基因定位克隆及其應用研究進展進行綜述。

1 赤霉素相關油菜矮稈基因定位克隆

GA是控制植物株高的重要植物激素,GA信號缺陷導致植物變矮。近20年來,多個與GA信號相關的油菜矮稈基因被分離和鑒定(表1)。1995年,Foisset等[7～9]通過甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)誘變“Primor”品種,篩選到一個矮稈突變體bzh。該突變體的矮稈性狀受單基因控制,矮稈相關基因Bzh定位于A6染色體上。經EMS誘變獲得的半矮稈突變體ds-1[10～11]由單個部分顯性基因BnaA6.rga-ds控制,其與Bzh互為等位基因,編碼GA信號抑制子RGA(repressor of ga l-3)蛋白。在突變體RGA蛋白的DELLA結構域中,VHYNP保守序列中的脯氨酸突變為亮氨酸(序列突變為VHYNL),致使突變體對GA不敏感,油菜株高變矮。與ds-1類似,EMS誘變雙低品種HS5獲得的矮稈突變體ds-3[12]對GA的敏感性降低,它受半顯性基因BnaC07.RGA控制,在該基因編碼的RGA蛋白的DELLA結構域中,VHYNP保守序列中的脯氨酸也突變為亮氨酸,導致RGA不能與GA受體GID1(GA-insensitive dwarf 1)相互作用,GA信號轉導受阻,RGA蛋白積累,最終植株矮化。白菜型油菜矮稈突變體dwf2[13～14]也是一個GA不敏感突變體,突變體中RGA基因編碼的DELLA蛋白C末端GRAS保守區域的第328位谷氨酰胺(Q)突變為精氨酸(R),致使RGA不能與E3泛素連接酶SCFSLY1相互作用,RGA蛋白降解受阻,GA信號減弱,植株變矮。經硫酸二乙酯(diethylsulfate,DES)與快中子照射聯合處理得到的矮稈突變體ndf-1[15～16]對GA也不敏感,在該突變體中,編碼GA受體的BnGID1基因啟動子嘧啶盒(P-box)序列有3個堿基發生突變(兩個TT突變為CC,1個G缺失),從而影響了BnGID1的正常表達,導致GA信號減弱,進而使植株變矮。因此,GA信號受體GID1或者GA信號關鍵抑制子DELLA家族蛋白RGA的量發生變化,都會影響GA信號的正常傳遞,進而控制油菜株高。

表1 油菜矮稈突變體及相關基因Table 1 Dwarf mutants and related genes of Brassica napus

此外,宋稀等[17]在田間獲得一個自然矮化突變體dw-1,其平均株高為95 cm,由1對加性-顯性主基因控制,并已被證明是GA響應減弱類型突變體。Zeng等[18]通過EMS誘變從甘藍型油菜自交系T6中獲得一個矮稈突變體bnaC.dwf。該突變體受1對隱性基因控制,對外源GA3處理不敏感,表明其GA信號轉導存在缺陷。目前,dw-1和bnaC.dwf矮稈性狀相關基因尚未定位克隆。

GA代謝過程發生變化也會影響植物株高。GA代謝途徑中的赤霉素2-氧化酶(GA 2-oxidase,GA2ox)能通過β-羥基化作用將活性GA1和GA4催化,形成無活性GA8和GA34,降低生物活性GAs的含量,進而影響植物株高。近幾年,課題組從甘藍型油菜中分離了兩個GA2ox基因BnGA2ox6和BnGA2ox2,發現BnGA2ox6異源表達到擬南芥中能夠使轉基因植株表現出GA缺乏表型,幼苗下胚軸變短,成年植株變矮;經外源GA3處理,植株又能夠恢復幼苗下胚軸長度和株高[19]。與Bn-GA2ox6類似,BnGA2ox2在擬南芥和油菜中異源表達或者過量表達時,導致擬南芥和油菜幼苗及成年植株矮化;噴施外源GA3也能夠恢復轉基因植株表型[20]。這些研究結果表明,BnGA2ox6和BnGA2ox2是兩個新的油菜矮稈相關基因。

2 生長素相關油菜矮稈基因定位克隆

生長素也是控制植物株高的主要植物激素之一。近年來,科研工作者陸續發現了多個與生長素信號轉導相關的矮稈突變體,并定位克隆了矮稈性狀相關基因(表1)。Zhao等[21]在“矮源1號”小孢子培養過程中獲得一個矮稈突變體ds-4,其成熟期株高為23 cm左右,受半顯性基因BnaC05.IAA7控制。該基因編碼生長素信號負調節子AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)蛋白 IAA7,突變體中AUX/IAA7蛋白保守區域第87位的脯氨酸突變為亮氨酸(序列GWPPV突變為GWLPV),使生長素誘導的AUX/IAA7與生長素受體TIR1(transport inhibitor response 1)的相互作用受到抑制,導致IAA7不能被降解而積累,植株莖的伸長生長受抑制而變矮。EMS誘變矮稈突變體sca[22]的株高為76 cm左右,受半顯性基因BnaA3.IAA7控制。該突變體IAA7蛋白第84位的甘氨酸突變為谷氨酸(序列GWPPV突變為EWPPV),破壞了保守結構域,降低了生長素誘導的BnaA3.IAA7與TIR1的親和力,抑制了低濃度生長素條件下BnaA3.IAA7蛋白降解和信號轉導,從而降低了油菜株高。顯性矮稈突變體g7[23]也可能與生長素信號受阻有關,其矮稈基因定位在C5染色體的0.6 Mb區間內,其中一個單核苷酸突變(G-A)使Bna.IAA7.C05編碼蛋白IAA7第89位甘氨酸突變為谷氨酸,即保守序列GWPPV突變為EWPPV,這可能與矮稈表型有關。課題組前期已將EMS誘變突變體 bnd2(Brassica napus dwarf 2)[24～25]的矮稈性狀相關基因BND2定位在A8染色體15.62 Mb至15.76 Mb的140 kb區間,該區域內有27個候選基因,其中BnaA08g20960D基因第5個內含子中存在一個單堿基突變(C-T),使得BnaA08g20960D的表達量降低。該基因與擬南芥編碼肌醇1,3,4,5,6-五磷酸-2激酶的AtIPK1基因同源,AtIPK1催化肌醇1,2,3,4,5,6-六磷酸(inositol hexakisphosphate,InsP6)生物合成中的最后一步[26]。InsP6已被證明是生長素受體TIR1的輔酶,能夠穩定TIR1蛋白構象,保證生長素有效地與TIR1活性位點結合,引發生長素響應[27～29]。因此,我們推測BnaA08g-20960D是BND2的候選基因,目前正在開展遺傳學驗證實驗。

此外,Zheng等[30]發現了一個自然矮稈突變體ed1,該突變體受一個半顯性基因控制,成熟期株高為23 cm左右,葉片卷曲。研究人員初步證明ed1是一個IAA/BR不敏感突變體,與IAA信號途徑有關。這為ed1矮稈性狀相關基因的定位提供了線索。

3 其他油菜矮稈突變體

浦惠明等[31]研究的甘藍型油菜矮稈品種“矮源1號”在成熟階段平均株高約為24 cm,矮稈性狀呈顯性。自然矮稈突變體99cdam[32]的株高約為85 cm,受3對隱性基因控制。矮稈突變體bndf-1[33]的株高約為75 cm,株型緊湊,矮稈性狀受單顯性基因控制。EMS誘變矮稈突變體bndwf1[34]的成熟期株高為80～110 cm,受單顯性基因控制;bndwf1突變體基因定位于A9染色體152 kb區間內,該區間包含14個注釋或預測的基因,其中7個可能與bndwf1的矮稈表型有關。EMS誘變矮稈突變體bndwf/dcl1[35]的株高為40～70 cm,受單顯性基因控制,該突變體基因定位于C5染色體175 kb區間內。矮稈新材料dw871[36～38]的株高性狀由1對顯性主基因控制,后者初步定位在A10染色體1.83 Mb區間內;該株系矮稈單株后代品質表現為雙低和雜黃籽,其豐產性與同源高稈品系相當,是甘藍型油菜新型矮稈種質資源。王偉榮等[39]在航空誘變甘藍型油菜品種“0602”“0607”“滬油12”“滬油14”和“滬油16”的后代中也發現了矮稈新材料。這表明航天誘變也是選育新品種的一條有效途徑。需要指出的是,上述矮稈突變體是否與GA、IAA、BR等植物激素生物合成或信號轉導有關尚不明確。

4 油菜矮稈基因應用研究

大量育種實踐表明,適當的株高對于提高抗倒性和產量尤為重要。傅廷棟[40]認為,半矮稈抗倒伏材料能使收獲速度增加25%;關周博等[41]提出,適合機械化收割的油菜品種一般以1.5～1.7 m株高為宜。近年來,科研工作者利用矮稈基因育成了一系列具有潛在應用價值的抗倒品種(系)、不育系和雜交組合。Wang等[42]將矮稈基因NDF-1轉育到雙低甘藍型油菜品系中,育成了矮稈雙低品系ddf-1和ddf-2,其單株種子產量、收獲指數和生物量都有了顯著的提高。ddf-1與高稈品系雜交獲得的F1植株株型理想,超親優勢率高達30%～40%。此外,該團隊利用NDF-1矮稈基因育成的矮稈核不育兩用系與高稈優良品系雜交,選育出了半矮稈抗倒、耐肥、耐密植且高產的強優勢雜交組合。另有研究人員將白菜型油菜矮稈突變體dwf2(brrga1-d)等位基因導入株型高大、易倒伏的甘藍型油菜中,顯著降低了株高,提高了抗倒伏性,且對油菜產量無明顯影響[14]。將矮稈突變體bndf-1與其他親本雜交,獲得的雜種F1的株高也顯著降低,同時產量也無顯著影響[33],提示該突變體具有較好的應用前景。將油菜矮稈突變體sca與油菜品種4312、ZS11和ZY821配組,獲得的雜交F1植株株高介于兩個親本之間,并且單株產量顯著高于兩個親本[22],表明這些雜交組合具有較強的產量雜種優勢。張瑞茂等[36～37]利用新選育的dw871矮稈材料開展了兩項轉育工作,一是將dw871矮稈直立株型轉育到現有的高稈甘藍型油菜品種,成功獲得了大量的矮稈直立株型常規品系;二是進行甘藍型油菜隱性核不育三系的轉育,獲得3份不同來源的甘藍型油菜隱性核不育三系,實現了三系配套。他們提供的多個矮稈直立株型甘藍型油菜新組合已在長江流域各省區市進行多點試驗與示范。最近,課題組將矮稈突變體bnd2與高稈品種L329雜交,發現雜交F1與L329相比,株高沒有增加,但是單株產量增加,提示bnd2可用于甘藍型油菜抗倒伏和高產雜交育種[25]。這種矮稈性狀并不影響雜種優勢的表現,并且以矮稈為母本,以高稈為父本,更有利于雜交制種。因此,矮稈基因在油菜雜交育種中具有極好的應用前景。

5 展望

盡管在甘藍型油菜中已經報道了多個矮稈突變體材料,定位克隆了多個矮稈基因,但由于與產量相關的其他農藝性狀受影響,所以產量降低,目前只有少數材料可用作實際育種資源。因此,選育具有育種應用價值的矮稈材料和定位克隆矮稈基因,仍然是未來的一個研究方向。

近年來,隨著參考基因組研究和高通量測序技術(next generation sequencing)發展,基于高通量測序技術與混合樣本分組分析(bulked segregant analysis,BSA)相結合的方法,即BSA-seq,加速了重要性狀相關基因的克隆。該方法已被成功地用于定位克隆油菜矮稈基因[25]。此外,新發展的油菜60K單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片可以用來快速對甘藍型油菜進行全基因組基因分型,以及快速鑒定與目標基因相關的SNP位點;油菜60K SNP芯片結合BSA方法可快速鑒定與目標基因連鎖的區段[43]。Hu等[44]將油菜60K SNP芯片與BSA分析相結合,在甘藍型油菜中鑒定出與裂葉相關的31個SNP,并通過傳統連鎖分析對這些位點進行了驗證。Li等[45]利用油菜SNP芯片和BSA分析,鑒定出兩個控制油菜分枝形成的主效數量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL)。這些生物技術手段和方法的綜合應用,將進一步提高油菜重要農藝性狀相關基因的定位克隆效率。

矮稈油菜在生產上具有巨大的應用價值,也是研究基因表達調控的重要材料。對自然或人工誘變的矮稈突變體的矮稈基因進行定位和克隆,將為培育豐產穩產、適宜機械化栽培的矮稈油菜品種提供理論依據。