豬CD205分子CysR-FN Ⅱ截短基因的克隆表達及應用

高文昊, 杜露平, 侯立婷, 于曉明, 陳 瑾, 馮秀麗, 鄭其升, 程海衛

(1.江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術研究中心/江蘇省食品質量與安全重點實驗室,江蘇南京210014；2.南京農業大學動物醫學院,江蘇南京210095；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇揚州225009)

樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)作為專職抗原遞呈細胞,可以借助其表面不同的受體進行抗原的捕獲、加工與遞呈,從而刺激機體產生免疫反應。1995年,Witmer-Pack等發現了小鼠DC細胞表面的一種特異性的抗原遞呈受體——CD205[1]。CD205屬于C型凝集素受體中的巨噬細胞甘露糖受體家族,又稱為DEC-205或Ly75[2],在組織中分布廣泛,高度表達于DC細胞和胸腺上皮細胞,在B細胞、T細胞、NK細胞和巨噬細胞中表達較少或幾乎不表達[3]。CD205是目前在機體淋巴器官T細胞區域的DC細胞中表達最廣泛的唯一受體[4],參與抗原遞呈過程并起到關鍵作用。研究結果顯示,與非靶向抗原相比較,CD205靶向可以使OVA抗原遞呈效率提高至少100倍,抗原用量減少近1 000倍[5]。通過將乙肝病毒preS抗原靶向至CD205,可以在小鼠體內產生高效的IgG1和IgG2a抗體反應,對乙肝病毒感染產生預防和治療效果[6-8]。上述研究結果顯示,CD205靶向可以減少抗原用量,誘導高效的免疫應答,在抗病毒感染方面具有良好的發展潛力,已成為新型疫苗制劑研發與應用領域的前沿熱點。

CD205靶向在獸醫領域研究日益受到關注,但其效應機制尚不清楚。本研究擬選擇豬CD205分子為研究對象,結合原核表達系統的諸多優勢[9],針對編碼豬CD205的N端胞外區的CysR-FNⅡ截短基因片段進行克隆表達及蛋白質純化,制備多克隆抗體,并對其功能進行鑒定,驗證本研究所獲得的重組蛋白的生物學活性,為豬CD205特異性抗體的研制及豬CD205抗原靶向研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6～8周齡ICR系清潔級雌性小鼠購于南京市青龍山動物繁殖場。RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒均為捷瑞公司的產品,熒光抗體(Anti-mouse-IgG FITC,anti-pig-CD1 APC)購于上海優寧維公司。大腸桿菌BL21、DH5α和pET-32a質粒均由本實驗室保存。根據NCBI上公布的編碼豬CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因(GenBank:GQ420669.1)設計PCR引物(表1),由上海生工生物有限公司合成。

表1 本研究用引物對序列

1.2 pET-32a-CysR-FN Ⅱ重組質粒的構建與蛋白質表達

1.2.1 豬淋巴總RNA的提取和cDNA的合成 取豬新鮮的淋巴結,運用Trizol法按照說明書操作提取RNA,按照反轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。

1.2.2CysR-FNⅡ截短基因的擴增及鑒定 以合成cDNA為模板,使用引物205R和205F,PCR擴增CysR-FNⅡ截短基因。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,54.5 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共30個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物進行瓊脂糖電泳鑒定,對目的條帶進行純化回收。將回收產物與 pMD18-T載體連接,轉化至DH5α感受態細胞,隨機挑選單克隆進行菌落PCR鑒定,將陽性克隆進行測序分析。

1.2.3 添加酶切位點 利用方法1.2.2所述陽性克隆為模板,使用引物205M-R和205M-F,通過PCR擴增在CysR-FNⅡ截短基因的兩端添加酶切位點。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共30個循環；72 ℃ 10 min。之后鑒定步驟同方法1.2.2。

1.2.4 重組表達質粒的構建 利用限制性內切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分別對方法1.2.3所述陽性克隆質粒和pET-32a質粒(本實驗室保存)進行雙酶切,酶切產物經1%瓊脂糖電泳鑒定,利用試劑盒進行純化和回收。經過夜連接后,轉化至BL21感受態細胞,通過菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定,陽性克隆進行測序分析。

1.2.5 重組蛋白的表達及純化 利用方法1.2.4所述陽性克隆接種至LB液體培養基中(含0.1%氨芐青霉素),37 ℃培養至對數期,加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),23 ℃進行誘導表達。之后,離心收集菌體,并使用高壓均質機進行高壓破碎,分別利用SDS-PAGE和Western Blot方法對表達產物進行鑒定。使用Ni2+親和層析柱純化,并進行鑒定。

1.3 CysR-FN Ⅱ多克隆抗體的制備與功能鑒定

1.3.1 小鼠免疫 使用純化后的目的蛋白對小鼠進行免疫,每只小鼠皮下免疫注射50 μg。注射后第14 d采血并收集血清。

1.3.2 抗體效價測定 利用純化后的目的蛋白作為抗原包被酶標板,將免疫后血清倍比稀釋,使用HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗,檢測免疫后14 d血清中CysR-FN Ⅱ抗體水平。

1.3.3 豬骨髓來源樹突狀細胞的誘導分化 參考Carrasco等的方法[10]誘導分化豬骨髓來源樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)。取新鮮的豬胸骨,使用PBS沖洗豬胸骨得到細胞懸液。裂解紅細胞后,使用淋巴細胞分離液Ficoll-Paque獲得淋巴細胞懸液,在補充有10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和50 μmol/L 2-巰基乙醇的RPMI-1640培養基中進行培養。使用25 ng/ml重組豬粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子誘導骨髓細胞分化,之后隔日半量換液,持續培養至第7 d,收獲細胞。

1.3.4 間接免疫熒光法鑒定 將方法1.3.3所獲得的新鮮豬BMDC培養于細胞爬片上,待細胞融合度達到75%時,取出爬片并用PBS漂洗。之后添加4%多聚甲醛固定15 min,使用1%Triton室溫透化5 min,PBS漂洗。分別使用免疫前血清和免疫后血清與豬BMDC細胞37 ℃孵育1 h。依次使用anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC、DAPI染色,用激光共聚焦顯微鏡(PerkinElmer公司)觀察。

1.3.5 流式細胞術分析 取方法1.3.3所獲得的新鮮豬BMDC(1 ml 1×106)于2支1.5 ml無菌離心管中,1支依次利用免前血清、anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC進行染色,另1支依次用免后血清、anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC染色。利用BD Accuri C6流式細胞儀分別檢測兩組豬BMDC中鼠IgG與豬CD1雙陽性(Mouse-IgG+CD1+)的數量,比較免疫前血清和免疫后血清孵育后豬DC細胞的特異性熒光強度。

2 結果與分析

2.1 CysR-FN Ⅱ基因的擴增及鑒定

以cDNA為模板,根據編碼豬CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因設計引物,進行PCR擴增及瓊脂糖電泳檢測。結果如圖1所示,泳道1在500 bp與750 bp之間出現目的基因條帶,大小與預期相符合。同時測序分析結果顯示序列正確,無突變。

2.2 CysR-FN Ⅱ基因酶切位點的擴增及鑒定

利用獲得的CysR-FNⅡ目的基因作為模板,并設計含酶切位點BamH Ⅰ和HindⅢ的引物,進行PCR擴增,擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖1所示,泳道2在500 bp與750 bp之間出現目的基因條帶,大小與預期相符合。同時測序分析結果顯示序列正確,無突變。

2.3 重組表達質粒pET-32a-CysR-FN Ⅱ的構建與鑒定

分別利用BamH Ⅰ和HindⅢ對pMD-18T-CysR-FNⅡ質粒和pET-32a質粒進行酶切鑒定,酶切產物經電泳檢測，結果如圖1所示,酶切處理前后的pMD-18T-CysR-FNⅡ片段大小與預期結果一致。回收目的條帶,并與pET-32a質粒雙酶切產物進行連接,構建重組表達質粒pET-32a-CysR-FNⅡ,轉化至BL21感受態細胞。進行PCR及雙酶切鑒定,結果如圖1所示,酶切處理前后的pET-32a-CysR-FNⅡ片段大小,與預期結果一致。所獲得的陽性克隆測序結果正確。

M1:DL2000 DNA marker,從上至下條帶依次為2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；泳道1：經PCR擴增的編碼豬CD205分子的CysR-FN Ⅱ截短基因；泳道2：CysR-FN Ⅱ酶切位點的鑒定；泳道M2: DL10000 DNA marker,從上至下條帶依次為10 000 bp、7 000 bp、4 000 bp、2 000 bp、1 000 bp、500 bp、250 bp；泳道3: 未經酶切處理的重組質粒pMD-18T-CysR-FN Ⅱ；泳道4：雙酶切重組質粒pMD-18T-CysR-FN Ⅱ的產物；泳道5：未經酶切處理的重組表達質粒pET-32a-CysR-FN Ⅱ；泳道6：雙酶切重組表達質粒pET-32a-CysR-FN Ⅱ的產物。

2.4 目的蛋白的可溶性表達與鑒定

重組表達質粒pET-32a-CysR-FNⅡ經IPTG低溫誘導后,收集菌體進行高壓破碎,并收集破碎后的樣品。分別用誘導前的全菌樣品、誘導后的全菌樣品、破碎后的上清液樣品以及破碎后的沉淀樣品進行SDS-PAGE與Western Blot鑒定。結果如圖2A所示,誘導后的全菌樣品(泳道2)以及破碎后的上清液樣品(泳道3)均在相對分子質量4.0×104左右出現目的條帶,相對分子質量與預期結果一致,且為可溶性表達。蛋白質印跡結果如圖2B所示,誘導后的全菌樣品(泳道2)以及破碎后的上清液樣品(泳道3)在約4.0×104處檢測到目的條帶。

2.5 重組蛋白CysR-FN Ⅱ的純化

重組表達質粒pET-32a-CysR-FNⅡ表達產物經過多次純化和SDS-PAGE鑒定,摸索出最適合的純化條件,即洗脫液含50 mmol/L咪唑時雜蛋白去除效率最高,且目的蛋白損失較少。純化后的目的蛋白經SDS-PAGE及Western Blot鑒定,結果如圖2A、2B所示,泳道5在4.0×104左右出現單一的目的條帶,純度估計在90%以上。

A圖為SDS-PAGE鑒定重組蛋白CysR-FN Ⅱ表達及純化結果,其中泳道M為蛋白質Marker,從上至下10條條帶相對分子質量依次為2.50×105、1.50×105、1.00×105、7.0×104、5.0×104、4.0×104、3.5×104、2.5×104、2.0×104、1.5×104；B圖為Western Blot鑒定重組蛋白CysR-FN Ⅱ表達及純化結果,其中泳道M為蛋白質Marker,從上至下3條條帶相對分子質量依次為5.0×104、4.0×104、3.5×104。泳道1：誘導前的全菌樣品；泳道2：誘導后的全菌樣品；泳道3：滲導后的全菌破碎后的上清液樣品；泳道4：誘導后的全菌破碎后的沉淀樣品；泳道5：滲導后的全菌純化后的目的蛋白樣品。

2.6 重組蛋白CysR-FN Ⅱ免疫小鼠血清抗體檢測

免疫注射后第14 d,采用間接ELISA方法,對血清中抗體效價進行檢測。結果如圖3所示,血清倍比稀釋至1∶6 400時,OD450數值僅為0.052,與陰性血清相比,P/N<1.5,判定為陰性,即抗體效價為1∶3 200。

圖3 重組蛋白CysR-FN Ⅱ免疫小鼠14 d后抗體效價測定

2.7 間接免疫熒光鑒定CysR-FN Ⅱ多克隆抗體與豬BMDC的共定位特性

利用獲得的新鮮豬BMDC,制作細胞爬片,分別與免前血清、免后血清進行孵育。PBS漂洗后依次使用anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC、DAPI染色,激光共聚焦顯微鏡觀察結果如圖4所示,免疫前血清試驗組中未觀察到綠色熒光,免疫后血清試驗組中在胞膜及胞質中可見綠色熒光,且與APC所標記的紅色熒光共定位,該結果表明本試驗所獲得的CD205多克隆抗體可以與豬BMDC發生特異性結合。

A組為免疫前血清實驗組;B組為免疫后血清實驗組。分別使用anti-mouse-IgG FITC；DAPI和anti-pig-CD1 APC進行標記。

2.8 流式細胞分析CysR-FN Ⅱ多克隆抗體與豬BMDC結合特性

利用獲得的新鮮豬BMDC,分別與免疫前血清、免疫后血清進行孵育,使用熒光抗體標記后,經流式細胞儀檢測豬BMDC的mouse-IgG+CD1+數。結果如圖5所示,左側曲線代表免疫前血清實驗組檢測到的綠色熒光強度，右側曲線代表免疫后血清實驗組檢測到的綠色熒光強度，免疫后血清的綠色熒光強度與免疫前相比明顯增強,表明本試驗所獲得的多克隆抗體可以與豬BMDC發生特異性結合。

圖中左側實線表示免疫前血清實驗組流式檢測FITC通道熒光強度，右側實線表示免疫后血清實驗組流式檢測FITC通道熒光強度。

3 討論

CD205作為首個報道的DC細胞特異性抗原遞呈受體,是在機體淋巴器官T細胞區域的DC細胞中表達最廣泛的唯一受體,在抗原遞呈過程中具有關鍵作用[11-12]。CD205作為抗原靶向的研究熱點,已經在多種病毒的疫苗設計中被研究[13-14]。同時針對免疫耐受的現象,可以通過CD205靶向抗體的作用,增強抗原的遞呈,激活DC細胞,進而誘導出病毒特異性的免疫反應[15]。截至目前,多個CD205靶向人用疫苗已進入臨床試驗階段[6-7]。CD205靶向在獸醫領域研究日益受到關注,但其效應機制尚不清楚,而關于CD205靶標蛋白的制備,均是利用真核系統進行表達制備,表達產物雖具有一定的生物學活性,但產量較低,耗時費力[16-18]。

本試驗擬利用原核系統表達編碼豬CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因,所制備的目的蛋白經SDS-PAGE和 Western Blot鑒定,均以可溶性形式表達,且相對分子質量與理論值一致。使用純化后的蛋白質對小鼠進行免疫,免疫后14 d抗體效價達1∶3 200。間接免疫熒光實驗和流式細胞分析結果均表明本試驗所制備的多克隆抗體可以與豬BMDC發生特異性結合,即本試驗所制備的目的蛋白具有一定的生物學活性。后續研究將利用所制備的CysR-FN Ⅱ目的蛋白,制備豬CD205特異性抗體,為研究豬CD205抗原靶向奠定基礎,并對CD205介導抗原靶向遞呈的作用機理進行研究,為新型疫苗設計提供參考依據。