葉用萵苣種質資源表型性狀及營養品質綜合評價

田雪珂， 鐘啟文， 孫雪梅， 張廣楠， 楊世鵬， 譚 龍， 王麗慧

(青海大學農林科學院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海西寧810016)

葉用萵苣(LactvcasativaL.)，又被稱為生菜，屬菊科萵苣屬，一年生或兩年生草本作物[1]，具有生育期短、產量高的特點，在設施栽培中應用廣泛[2]。葉用萵苣喜冷涼[3]，可分為皺葉生菜、散葉生菜、結球生菜三類[4]。葉用萵苣含有豐富的類胡蘿卜素、維生素C、可溶性碳水化合物等營養物質[5]，具有降血壓、預防心律失常[6]等保健功能。維生素C通常被轉化成2種形式：一是抗壞血酸(AA)，具有抗氧化特性；二是氧化產物脫氫抗壞血酸(DHAA)[7]，用于維持人體正常生長發育。維生素C人體不能自身合成，必須通過食物獲取，且容易被高溫破壞，而葉用萵苣營養豐富，可做涼菜食用[8]，作為補充維生素C的蔬菜具有較大優勢。

種質資源是研究作物遺傳生長的基礎[9]，也是影響現有遺傳資源質量和數量、創新改良深度以及支持當今農業發展的關鍵因素[10]。種質資源鑒定是科學研究的主要任務之一。通過資源的鑒定，評價遺傳資源在生產和科研方面的應用潛力[11]。種質資源表型評價比分子評價更為直接，已被廣泛應用于核心種質的構建和分類[12]。如Lebeda等利用該方法對野生萵苣進行農藝性狀的調查[13]。董潔等[14]利用表型評價對55份葉用萵苣進行研究，其變異系數分布范圍為8.82%～98.85%。目前隨著中國對生菜多樣性需求的增加，資源的引進和種質資源的豐富顯得極其重要。種質資源引進是豐富遺傳資源多樣性的重要手段[15-17]。據不完全統計，截至2021年中國已收集萵苣資源4 000份[18]，并開展了農藝性狀調查、抗病試驗、品質分析，通過試驗驗證培育出了一些優良品種。采用主成分分析、聚類分析、多樣性指數等統計分析方法對種質資源質量進行綜合評價，可使質量評價更加科學可靠。近年來，將主成分分析和聚類分析相結合的綜合評價分析方法應用于葡萄[19]、楊梅[20]、蘋果[21]、獼猴桃[22]和枸杞子[23]等果實品質評價的研究已成為熱點。

本研究以青海省農林科學院收集的13份葉用萵苣種質資源為材料，于2021年在青海省西寧市園藝創新基地進行栽培及鑒定，對葉形和葉色等質量性狀以及葉柄厚等數量性狀進行評價，結合聚類分析和主成分分析進行綜合評價并篩選優良種質。

1 材料方法

1.1 試驗材料

供試材料為青海大學農林科學院園藝創新基地收集到的葉用萵苣種質資源，共計13份。

1.2 試驗方法

調查并記錄葉用萵苣的株高、葉長、葉寬、葉柄長、葉柄厚、葉柄寬、葉數。對質量性狀進行賦值并將數據進行標準化，賦值標準參考李錫香等[24]的《萵苣種質資源描述規范和數據標準》(表1) 。

表1 葉用萵苣種質資源10個描述型性狀及分級標準

試驗材料于2020年種植于青海省農林科學院園藝創新基地，從每份材料中選擇3株生物學重復對其農藝性狀進行調查，并選取3個獨立的生物學樣本用于后續營養指標的測定。栽培基質為珍珠巖∶蛭石=1∶1(質量比)，混合均勻。

1.3 數據統計分析

使用Excel2019對測試數據進行整理，利用SPSS21.0對數據進行統計分析、聚類分析、主成分分析。并對13份葉用萵苣種質資源的10個農藝性狀及6個營養指標的平均值(μ)、范圍(R)、標準差(s)、變異系數(CV)和多樣性指數(H′)，使用Duncan’s多重比較法分析差異的顯著性。根據各性狀數據的平均值和標準差對多樣性指數進行分級，分為9個級別：第1級為[Xi<(μ-2.0s)]，[Xi<(μ-1.5s)]為第2級，每級增加0.5s，至第9級為[Xi>(μ+2.0s)]。因此，根據相對頻率(Pi)計算多樣性指數H′。采用香農多樣性指數(H′)，計算公式如下[25]：

隸屬函數計算公式如下[26]：

Xi為所調查各指標的測定值，Xmax、Xmin為樣品某一指標的最大值、最小值。

1.4 營養品質性狀測定

1.4.1 可溶性蛋白質含量測定 參考王學奎等方法[27]進行測定。

1.4.2 有機酸含量測定 有機酸提取方法：預冷研缽，稱取2 g葉片，加入2.5 ml KH2PO4緩沖液，研磨均勻，再用2.5 ml KH2PO4緩沖液沖洗研缽，移至10 ml離心管中，定容，12 000 r/min離心10 min，取1 ml上清液，過0.22 μm濾膜，放入樣品瓶中采用二元梯度液相色譜儀進行測定。流動相A為緩沖液KH2PO4，流動相B為甲醇(色譜純)，流速0.5 ml/min，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm、214 nm，進樣量20 μl。

1.4.3 可溶性碳水化合物含量測定 可溶性碳水化合物的提取方法：稱取肉質莖粉末0.84 g于試管中，加20 ml超純水，搖勻，沸水浴30 min，晾至室溫，將上清液倒入10 ml離心管中，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用蒸餾水定容至25 ml。取上清液1 ml，過0.22 μm過濾器，用高效液相色譜儀測定可溶性碳水化合物含量。流動相為超純水，進樣量5 μl，柱溫80 ℃，流速1 ml/min。

1.5 試驗儀器

可溶性碳水化合物含量測定儀器：日本島津高效液相色譜儀(RID-20A)，色譜柱Shodex SUGAR SC1011，預柱Shodex SUGAR SC- G6B，檢測器為示差檢測器。有機酸含量測定儀器：日本島津高效液相色譜儀(SPD-20A)，色譜柱Shodex SUGAR SC18，預柱Shim-pack GIST，檢測器為紫外檢測器。分光光度計：Specord210plus型可見光分光光度計(德國耶拿分析儀器股份公司產品)，離心機：AG 22331 Hamburg 型離心機(Eppendorf公司產品)。

2 結果與分析

2.1 葉用萵苣種質資源農藝性狀及營養品質的遺傳多樣性分析

由表2可知，13份葉用萵苣種質資源的16個性狀均呈現不同程度的多樣性，各指標的變異系數范圍為17.94%～91.86%，其中蘋果酸含量的變異系數最高(91.86%)，變幅為882.13～9 528.48 μg/g，其余指標的變異系數依次排列為葡萄糖含量(59.61%)>蔗糖含量(56.24%)>抗壞血酸含量(55.38%)>葉柄長(48.2%)>果糖含量(44.48%)>葉片數(38.41%)>葉柄厚(32.54%)>葉柄寬(27.51%)>葉寬(27.06%)>單株質量(24.53%)>干質量(24.06%)>株高(23.89%)>葉長(23.52%)> 鮮質量(20.80%)，可溶性蛋白質含量的變異系數最小，為17.94%，變化范圍為2.72～5.19 mg/g。其中葉柄長、葉柄厚、葉片數、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量、抗壞血酸含量和蘋果酸含量變異系數均≥30%，具有較大的改良潛力。多樣性指數的變化范圍為1.38～1.99，以葉長為最大，其余依次是單株質量>葡萄糖含量>抗壞血酸含量>葉寬>葉柄長=果糖含量>可溶性蛋白含量>株高=葉柄寬=葉柄厚=鮮質量>干質量>蔗糖含量>蘋果酸含量，葉片數的多樣性指數最小，為1.38，所有性狀的的多樣性指數均大于1.3。

表2 葉用萵苣種質資源表型及品質性狀的變異情況

2.2 葉用萵苣主要農藝性狀的鑒定評價

葉片是葉用萵苣的主要食用部位[4]。13份葉用萵苣種質資源中，結球萵苣1份，散葉萵苣12份。其中紫葉萵苣有6份，綠葉萵苣7份。各性狀調查結果見表3。由表3可以看出，葉用萵苣的農藝性狀表現出多種類型，其中結球萵苣為綠葉萵苣(那羅)，且結球性較松。葉片形狀以提琴形為主，匙形次之。葉尖分為圓形、鈍尖、尖。葉緣以鈍齒狀為主。葉裂以無裂為主。葉面均有光澤。葉片顏色以淺綠色和紫紅色為主。

表3 13 份葉用萵苣種質資源形態學特征

2.3 葉用萵苣資源基本性狀的相關性

葉片是葉用萵苣加工利用的主要部分，在葉用萵苣栽培過程中，選擇葉片較長、較寬且單株質量較大的資源具有重要意義。由表4可知，樣品干質量與葉柄寬相關性最大，為0.890；葉寬與可溶性蛋白質含量呈正相關關系，與葉片數呈負相關關系。葉長與葉柄長、果糖含量正相關，葉柄寬與葉柄厚正相關，樣品鮮質量、干質量均與單株質量極顯著正相關。在實際生產中，株高可以用葉長來衡量，而利用葉柄長短可以衡量葉片的長度，從而預測葉用萵苣的產量和品質。

表4 葉用萵苣16個基本性狀的相關性

描述型性狀及分級標準見表1。

2.4 葉用萵苣資源來源及隸屬函數分析

由表5可知，13份葉用萵苣資源的隸屬函數均值介于0.427～0.532，隸屬函數均值為0.493。大于均值的資源名稱分別是京研羅馬、超級意大利、紅象、紅莎、綠雅、普希金、羅生1號、綠莎及貝爾紫。其中羅生1號均值最高(0.532)，原因是該材料在表型性狀上極具優勢，尤其是集中在葉寬、鮮質量及單株質量方面。

表5 13份葉用萵苣資源10個性狀隸屬函數均值

2.5 葉用萵苣種質資源聚類分析

利用SPSS16.0對13份葉用萵苣資源農藝性狀進行聚類分析(圖1)，在歐氏距離為4處將13份葉用萵苣資源聚為5大類。其中，類群1中包括5份資源，該類資源的葉長分布在13.07～19.53 cm，干質量分布在2.87～3.38 g，單株質量分布在54.27～57.91 g。類群2包括1份資源。類群3包括3份資源，該類資源的株高主要分布在23.03～26.83 cm，葉柄厚主要集中在2.29～2.45 mm。類群4包括3份資源，該類資源的葉寬分布在10.93～11.40 cm，鮮質量主要分布在75.38～76.36 g。類群5包括1份資源。

圖1 13份葉用萵苣資源基于10個性狀的聚類結果

2.6 葉用萵苣種質資源主成分分析

以特征值大于1、方差貢獻率在80%以上為標準，對葉用萵苣16個指標進行主成分分析，得到累計方差貢獻率為95.44%，可以解釋近90%的遺傳信息。

質量指標聚類分析可以從多個維度分析評價指標[28-29]。由表6可知，第1主成分因子能夠反映原始數據中41.804%的信息，其中與株高、葉長和葉寬相關的指數因子載荷值高于0.817。第2主成分因子的方差貢獻率為21.157%，主要由樣品的鮮質量和干質量決定，負荷值分別為0.811和0.691。葉用萵苣的產量取決于植株高度、葉片長度、葉片寬度和鮮質量[30]，增加其中一個可以提高產量，因此第1和第2主要成分可以定義為產量影響因子。第3主成分因子的方差貢獻率為18.093%，決定其大小的分別為單株質量、可溶性蛋白質含量和抗壞血酸含量，特征值分別為0.419、0.663和0.701。決定第4主成分大小的因子主要為葉柄厚及葉片數，特征值分別為0.474和0.650。第5主成分因子的方差貢獻率為6.798%，各指標之間相差不大，僅抗壞血酸、果糖含量等表現較為突出，因此可將第3、4、5主成分命名為營養成分影響因子。前5個主成分共篩選出株高、鮮質量、單株質量、可溶性蛋白質含量、葉柄厚、抗壞血酸含量、果糖含量7個代表性指標，作為葉用萵苣種質資源評選和選育工作的重要指標。

表6 葉用萵苣種質資源主成分特征值

以X1～X16分別代表標準化的16個指標數據數值代入到2個主成分中，獲得5個主成分因子得分公式[31-32]如下：F1=0.096X1+0.094X2+0.849X3+0.367X4+0.744X5+0.784X6-0.517X7+0.303X8+0.637X9+0.681X10+0.641X11+0.156X12+0.601X13+0.871X14+0.333X15+0.507X16，F2=-0.199X1-0.224X2+0.048X3-0.870X4+0.556X5+0.152X6-0.482X7+0.811X8+0.691X9+0.431X10+0.075X11+0.105X12-0.095X13-0.217X14-0.160X15-0.743X16，F3=-0.229X1-0.338X2+0.272X3+0.238X4-0.184X5+0.077X6-0.041X7+0.328X8-0.146X9+0.419X10+0.663X11-0.941X12-0.452X13-0.44X14+0.701X15+0.189X16，F4=-0.236X1-0.008X2-0.387X3+0.096X4+0.044X5+0.474X6+0.650X7-0.087X8+0.044X9-0.014X10-0.159X11-0.167X12+0.322X13+0.216X14+0.306X15+0.208X16，F5=0.164X1+0.057X2-0.115X3-0.132X4+0.267X5-0.180X6+0.110X7-0.303X8+0.290X9-0.340X10+0.135X11+0.147X12-0.553X13+0.174X14+0.493X15+0.009X16。各指標綜合得分公式為F=0.418F1+0.212F2+0.181F3+0.076F4+0.068F5，按照計算公式得到葉用萵苣種質資源綜合得分。綜合得分越大，種質資源越好。由表7可知，綜合得分排名較高的4個品種依次為普希金(3.65)>超級意大利(3.47)>綠雅(2.75)>京研意大利(1.98)，在種質資源應用中可優先考慮這些品種。

表7 葉用萵苣性狀綜合評價表

2.7 葉用萵苣農藝性狀顯著性差異分析

由表8可知，各品種之間農藝性狀存在顯著差異。貝爾紫的株高最高，為27.27 cm，株高最小的品種為那羅(13.83 cm)。葉長最大的品種為京研羅馬(25.33 cm)，最短的品種為鳳蝶(11.27 cm)。葉寬值最大的品種為紅莎，最小的品種為鳳蝶(僅為5.17 cm)。葉柄最長的品種為綠雅，京研羅馬次之；葉柄最寬的為普希金，最窄的為鳳蝶；葉柄厚最厚的為超級意大利，最薄的為紅莎(0.91 mm)；葉片數最多的品種為鳳蝶，最少的品種為紅莎和綠雅。樣品鮮質量和干質量最大的品種為超級意大利和普希金，最低的品種均為鳳蝶。單株質量最大的為超級意大利，京研羅馬次之。綜上所述，京研羅馬的農藝性狀表現較好，在品種選育時可重點關注該品種。

表8 13份葉用萵苣資源農藝性狀差異顯著性分析

2.8 葉用萵苣營養成分差異顯著性分析

由圖2可知，綠莎的抗壞血酸含量最高，為290.35 μg/g，含量最低的為羅生1號(29.53 μg/g)。蘋果酸的含量最高的品種為京研羅馬(9 528.48 μg/g)，最低的品種為普希金(882.13 μg/g)。貝爾紫中可溶性蛋白質含量最高，為5.19 mg/g，含量最低的品種為雅丹，僅為2.72 mg/g，極差為2.47 mg/g。葉片中果糖含量最高的品種為綠雅，達到215.43 mg/g，超級意大利次之，果糖含量為181.08 mg/g，鳳蝶的果糖含量最低，僅為43.91 mg/g。葡萄糖含量最高的品種為超級意大利，為226.51 mg/g。蔗糖含量最高的品種為貝爾紫，為221.46 mg/g，紅莎的蔗糖含量最低，為27.62 mg/g。綜上所述，貝爾紫的可溶性蛋白質含量及蔗糖含量較高，在生產中可根據需求培育高品質的品種。

A:綠雅；B：超級意大利；C：羅生1號；D：貝爾紫；E：紅象；F：綠莎；G：京研羅馬；H：雅丹；I：那羅；J：紅莎；K：鳳蝶；L：普希金；M：京研意大利。同一指標中不同小寫字母代表0.05水平差異顯著。

3 討論

3.1 葉用萵苣資源表型性狀及營養品質的多樣性

植物的表型性狀具有較為直觀、便于調查等特點，是評價種質資源多樣性的重要指標。表型性狀受遺傳因素與環境因素的共同影響。株型中的重要表型性狀是株高和莖粗，能夠反映植株的活力及生長狀況[33]。本研究對13份葉用萵苣的10個農藝性狀及6個營養成分進行多樣性指數計算、主成分分析、生理指標的測定，結果表明這些種質資源的遺傳背景較為豐富，這與小麥[34]、高粱[35-36]、黃瓜[37]等其他作物的研究結果相似。變異系數通常用來反映性狀之間的離散程度以及在種質資源之間的變異程度[38-39]。本研究中測得的指標數據的變異系數均大于10%，變異系數最大的是蘋果酸含量，為85%，變化范圍為882.13～9 528.48 μg/g，可溶性蛋白質含量的變異系數最小(17.94%)，變化范圍為2.72～5.19 mg/g，表明所收集到的資源遺傳多樣性較為豐富。

3.2 葉用萵苣種質資源表型性狀及營養品質的綜合評價

基于主成分分析進行種質資源表型性狀評價已廣泛應用于西瓜[40]、番茄[41]、桃子[42]、柑橘[43]等作物。本研究中將16個性狀分為5個主成分，累計貢獻率達到95.44%，將1、2、3主成分歸為產量影響因子，4、5主成分歸為營養成分影響因子， 各主成分所包含的性狀可以作為葉用萵苣種質資源創新的參考。

聚類分析可根據性狀的相似程度對資源進行分類，用于反映親緣關系的遠近[44-46]。基于表型性狀對物種進行聚類分析已被廣泛應用于蔬菜研究中。如王業社等[47]利用聚類分析方法將紫薇品種劃分為5大類群，將具有相對一致特征的品種劃分為一個類群，組群間具有較大的差異。本研究把13份葉用萵苣材料分為5個群，類群1中包括6份資源，該類資源的葉長分布在13.07～19.53 cm，干質量分布2.87～3.38，單株質量分布在54.27～57.91 g。類群2包括1份資源。類群3包括3份資源，該類資源的株高主要分布在23.03～26.83 cm，葉柄厚主要集中在2.29～2.45 mm。類群4包括3份資源，該類資源的葉寬分布在10.93～11.40 cm，鮮質量主要分布在75.38～76.36 g。類群5包括1份資源。開展種質資源評價是種質資源篩選的主要環節，根據篩選結果可以選出大量優異種質資源。本研究根據綜合得分對13份葉用萵苣種質資源進行評價，綜合得分排名較高的4個品種依次為普希金(3.65)>超級意大利(3.47)>綠雅(2.75)>京研意大利(1.98)，在后續品種選育過程中可根據品種抗逆性及產量穩定性等持續觀測。