同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒試紙條與ELISA 方法比較分析

劉衛(wèi)平

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，齊齊哈爾 161000）

馬鈴薯具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。它既可作為糧食，又可作為蔬菜，還可作為飼料和工業(yè)原料，是具有多種用途的經(jīng)濟(jì)作物；馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)成分既豐富又齊全，集蔬菜與糧食作物的優(yōu)點(diǎn)于一身，且彌補(bǔ)了蔬菜及糧食作物營(yíng)養(yǎng)中的不足。世界范圍內(nèi)，中國(guó)馬鈴薯的種植面積最大、總產(chǎn)量最高，但單產(chǎn)水平低，黑龍江省馬鈴薯單產(chǎn)水平低于世界平均單產(chǎn)水平。造成馬鈴薯單產(chǎn)水平低的主要原因是馬鈴薯脫毒種薯的質(zhì)量達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1]，容易被馬鈴薯病毒侵染而退化，致使馬鈴薯的產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降。馬鈴薯病毒的檢測(cè)技術(shù)是提高馬鈴薯脫毒薯質(zhì)量的主要技術(shù)手段[2]。目前國(guó)內(nèi)外通用的檢測(cè)馬鈴薯病毒的技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)（以下簡(jiǎn)稱ELISA 方法），這是一種在實(shí)驗(yàn)室由專門的技術(shù)人員利用精密儀器才能完成的實(shí)驗(yàn)；該項(xiàng)技術(shù)不能推廣應(yīng)用普及到基層單位，大部分馬鈴薯種薯企業(yè)、合作社及種植大戶不能利用這項(xiàng)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)本企業(yè)、本合作社馬鈴薯田的馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，也就不能對(duì)馬鈴薯病毒及時(shí)地進(jìn)行防控，造成馬鈴薯病毒感染，馬鈴薯田的病毒感染率超出馬鈴薯種薯的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，致使馬鈴薯脫毒種薯的質(zhì)量差[3]，馬鈴薯單產(chǎn)水平低，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家的馬鈴薯單產(chǎn)水平。

荷蘭馬鈴薯種薯的質(zhì)量高，出口到很多國(guó)家，主要是因?yàn)楹商m有很好的馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證體系。馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證是控制馬鈴薯種薯質(zhì)量最有效的手段。利用同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條對(duì)馬鈴薯的各個(gè)級(jí)別的種薯田進(jìn)行病毒檢測(cè)，可以提高馬鈴薯種薯企業(yè)和合作社馬鈴薯種薯的質(zhì)量，使各個(gè)級(jí)別的馬鈴薯種薯的質(zhì)量達(dá)到國(guó)家種薯標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)認(rèn)證合格后，準(zhǔn)許進(jìn)入馬鈴薯種薯市場(chǎng)。為了建立我國(guó)完善的馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證體系，全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心為探索種子質(zhì)量認(rèn)證制度，總結(jié)種子認(rèn)證工作內(nèi)在規(guī)律，完善種子認(rèn)證程序，從2017 年開始進(jìn)行了種子認(rèn)證試點(diǎn)示范項(xiàng)目的田間檢驗(yàn)，為建立健全種子認(rèn)證制度提供科學(xué)依據(jù)。參加種子認(rèn)證試點(diǎn)示范項(xiàng)目的企業(yè)有雪川農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司、黑龍江龍薯馬鈴薯種薯繁育有限公司、內(nèi)蒙古坤元太和農(nóng)業(yè)科技有限公司、黑龍江萬(wàn)田金農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司、寧夏固原天啟薯業(yè)有限公司、依安縣天潤(rùn)薯業(yè)有限公司。參加田間檢驗(yàn)的品種有費(fèi)烏瑞它（原種、一級(jí)種）、夏波蒂（原種）、中薯5 號(hào)（原種、一級(jí)種）、興佳2 號(hào)（原種、一級(jí)種）、尤金（原種、一級(jí)種）、雪川1號(hào)（原種）、青薯9 號(hào)（原種）。通過(guò)幾年來(lái)馬鈴薯種子認(rèn)證試點(diǎn)示范項(xiàng)目的田間檢驗(yàn)，取得了良好的效果，上述企業(yè)的種薯均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，以此可以帶動(dòng)所有的馬鈴薯種薯企業(yè)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證；每個(gè)企業(yè)和種薯質(zhì)量監(jiān)管部門均可以利用同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒試紙條監(jiān)控馬鈴薯田6 種馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，為馬鈴薯的綜合防控和馬鈴薯種薯級(jí)別的定級(jí)提供理論基礎(chǔ)。我國(guó)馬鈴薯種薯的質(zhì)量和產(chǎn)量將有大幅度提高。

1 兩種馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)原理對(duì)比

膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。該方法也就是免疫層析法，現(xiàn)已發(fā)展成為常用的試紙條檢測(cè)，使用十分方便。

ELISA 方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA 檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA 方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

2 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)地點(diǎn)的對(duì)比

常規(guī)的ELISA 方法檢測(cè)馬鈴薯病毒只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，對(duì)于有檢測(cè)馬鈴薯病毒能力的科研單位、大學(xué)，需要到馬鈴薯田把馬鈴薯葉片采集到實(shí)驗(yàn)室即可做馬鈴薯病毒檢測(cè)；對(duì)于沒有馬鈴薯病毒檢測(cè)能力的馬鈴薯種薯企業(yè)、合作社、種植大戶，需要到馬鈴薯田采集馬鈴薯葉片，進(jìn)行保鮮處理，然后將樣品送到或郵到具有馬鈴薯病毒檢測(cè)資質(zhì)的科研單位的實(shí)驗(yàn)室等候檢測(cè)。

快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒可以在任何有馬鈴薯的地方，比如田間地頭、貯藏窖、馬鈴薯的發(fā)運(yùn)地點(diǎn)、海關(guān)等地進(jìn)行就地取樣、就地檢測(cè)、就地讀取馬鈴薯病毒檢測(cè)結(jié)果，還可以及時(shí)地根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行馬鈴薯病毒的綜合防控和馬鈴薯脫毒種薯的定級(jí)。

3 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)儀器和檢測(cè)人員的對(duì)比

利用ELISA 方法進(jìn)行馬鈴薯病毒檢測(cè)必須經(jīng)過(guò)精密的高價(jià)格儀器才能讀取出檢測(cè)結(jié)果；而快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒的結(jié)果讀取不需要經(jīng)過(guò)儀器，只是通過(guò)肉眼就可讀取。

ELISA 方法檢測(cè)必須要由專門的技術(shù)人員進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，需要配制多種檢測(cè)所需的試劑，需要調(diào)試并應(yīng)用多臺(tái)高精密儀器；而快速檢測(cè)馬鈴薯病毒的試紙條的使用者很廣泛，任何馬鈴薯的種植者都能夠利用該試紙條進(jìn)行馬鈴薯病毒的檢測(cè)。

4 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)費(fèi)用的對(duì)比

ELISA 方法檢測(cè)因檢測(cè)步驟繁瑣，且每個(gè)步驟孵育的時(shí)間較長(zhǎng)，完成整個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間需要2d；而快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒只需要5～10min就能完成。

ELISA 方法檢測(cè)，如果是檢測(cè)馬鈴薯的6 種主要的病毒，每份樣品需要150 元；如果馬鈴薯種薯企業(yè)、合作社以及種植大戶本身沒有檢測(cè)能力，需要將樣品送到具有馬鈴薯病毒檢測(cè)資質(zhì)的單位進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品需要480 元；如果利用本團(tuán)隊(duì)研究的同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條進(jìn)行馬鈴薯病毒的檢測(cè)，每份樣品只需要70 元。由此看來(lái)，利用快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒的費(fèi)用是最低的。

5 兩種檢測(cè)技術(shù)靈敏度的對(duì)比

ELISA 方法檢測(cè)的靈敏度是10ng/mL，快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒的靈敏度是1ng/mL；由此看來(lái)，快速試紙條的檢測(cè)靈敏度高于常規(guī)的ELISA 方法檢測(cè)的靈敏度。

6 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果讀取方法的對(duì)比

常規(guī)的ELISA 方法檢測(cè)不能現(xiàn)場(chǎng)取樣出檢測(cè)結(jié)果，快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒可以現(xiàn)場(chǎng)取樣、現(xiàn)場(chǎng)出檢測(cè)結(jié)果。常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)中6 種馬鈴薯病毒需要6 個(gè)聚苯乙烯反應(yīng)板才能夠完成檢測(cè)；快速檢測(cè)試紙條馬鈴薯6 種病毒的檢測(cè)僅需要1 個(gè)試紙條就能夠檢測(cè)；常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)需要依靠?jī)x器讀取馬鈴薯病毒檢測(cè)的結(jié)果，快速檢測(cè)試紙條只靠肉眼就能讀取檢測(cè)結(jié)果。

7 快速檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)

試紙條包括樣品墊、金標(biāo)墊、NC 膜、檢測(cè)線T線、質(zhì)控線C 線、吸水墊、PVC 底板。（1）將NC 膜粘貼在PVC 底板上；（2）將金標(biāo)墊搭接在NC 膜一端的上方，搭接長(zhǎng)度為1～2mm；（3）將吸水墊搭接在NC 膜另一端的上方，搭接長(zhǎng)度為2～3mm；（4）將樣品墊搭接在金標(biāo)墊的上方，搭接長(zhǎng)度為2～3mm；（5）在斬切機(jī)中將粘貼好的PVC 底板剪切成條；（6）剪切成條后裝殼并和干燥劑一并裝入鋁箔袋，密封后貼上標(biāo)簽。

特點(diǎn):（1）方便、適用性廣。試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒無(wú)需專門的技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室完成，只需馬鈴薯種植者在馬鈴薯田間即可監(jiān)測(cè)病毒的發(fā)生情況；為馬鈴薯病毒的綜合防控、馬鈴薯種薯定級(jí)提供技術(shù)支持。（2）快速。一個(gè)試紙條可在5～10min 時(shí)間內(nèi)肉眼診斷出馬鈴薯是否感染病毒。（3）靈敏度、準(zhǔn)確性高，特異性、穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測(cè)成本低。

8 討論

利用快速檢測(cè)試紙條對(duì)雪川農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司、黑龍江龍薯馬鈴薯種薯繁育有限公司、內(nèi)蒙古坤元太和農(nóng)業(yè)科技有限公司、黑龍江萬(wàn)田金農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司、寧夏固原天啟薯業(yè)有限公司、依安縣天潤(rùn)薯業(yè)有限公司6 個(gè)企業(yè)的馬鈴薯品種進(jìn)行了病毒檢測(cè)，馬鈴薯Y 病毒和馬鈴薯S 病毒的檢出率最高，均是9%。因?yàn)轳R鈴薯Y 病毒的傳播方式除了靠汁液摩擦傳播外，還主要依靠馬鈴薯蚜蟲傳播；馬鈴薯S 病毒是6 種馬鈴薯主要病毒中最難脫出的病毒；但是每個(gè)企業(yè)的馬鈴薯病毒的發(fā)生率均在馬鈴薯種薯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的允許范圍內(nèi)，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

同步快速檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條使馬鈴薯病毒的檢測(cè)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向田間地頭，檢測(cè)人員由專門的技術(shù)人員變?yōu)槿魏务R鈴薯種薯種植者。每個(gè)馬鈴薯種植企業(yè)和合作社均會(huì)使用該試紙條監(jiān)控和檢測(cè)馬鈴薯種薯田馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，為馬鈴薯種薯級(jí)別的定級(jí)和馬鈴薯病毒的綜合防控提供依據(jù)。每個(gè)企業(yè)可以利用試紙條了解馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，及時(shí)采取防控措施，確保馬鈴薯種薯的質(zhì)量。同步快速檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條在保證馬鈴薯種薯健康中起到關(guān)鍵作用。