黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片化學成分及體外抗氧化活性比較研究

吳紅偉，李東輝，宋沁潔，李國峰，李咸慰，楊新榮，李越峰, 3*

黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片化學成分及體外抗氧化活性比較研究

吳紅偉1, 2，李東輝1, 2，宋沁潔1, 2，李國峰1, 2，李咸慰1, 2，楊新榮1, 2，李越峰1, 2, 3*

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

采用HPLC、UV等方法測定并比較黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統飲片的指標性成分及體外抗氧化活性，為不同加工方式的黃芪飲片質量控制提供科學依據。采用HPLC、UV等方法對黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統飲片的7種指標性成分（黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物）進行含量測定，采用熵權法結合逼近理想解排序法（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）評價不同產地加工方式對黃芪藥材質量的影響，并結合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等化學計量學方法對黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統飲片進行區分和比較，同時以DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基清除能力為評價指標對黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統飲片的體外抗氧化活性進行比較。通過熵權綜合評分法比較2種不同加工方式對黃芪飲片質量的影響，結果發現黃芪趁鮮切制飲片綜合評分均高于黃芪傳統飲片；同時，黃芪趁鮮切制飲片組與黃芪傳統飲片組在體外抗氧化活性方面，DPPH自由基清除能力的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為5.560、8.168 mg/mL，羥基自由基清除能力的IC50分別為10.994、15.045 mg/mL，ABTS自由基清除能力的IC50分別為8.126、14.546 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制飲片體外抗氧化活性強于黃芪傳統飲片。通過熵權TOPSIS綜合評分法結合化學計量學分析方法及體外抗氧化活性對黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統飲片進行分析，為不同加工方式的黃芪飲片質量控制提供參考。

黃芪；產地加工；體外抗氧化；化學模式識別分析；質量控制；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；芒柄花苷；毛蕊異黃酮；總黃酮；總多糖；水溶性浸出物

黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge.的干燥根。具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效[1]。現代研究表明，黃芪具有增強機體免疫力[2]、抗氧化[3]、利尿[4]、保護肝腎[5]及抗腫瘤[6]等藥理作用。中藥材產地加工是指將采收到的中藥材經過初步加工和干燥處理等過程后形成商品藥材的過程，是影響中藥材品質的重要環節[7]，課題組前期研究發現，產地加工方式對黃芪品質的形成具有重要影響[8-9]。現代研究表明黃芪主要化學成分包括黃酮類、多糖類、皂苷類及氨基酸類[10]，而《中國藥典》2020年版以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷為含測指標性成分對黃芪進行質量評價，對黃芪藥材及飲片質量控制具有一定指導意義，但黃芪除含有以上化學成分外，還含有黃芪多糖、毛蕊異黃酮等成分，這些成分也為黃芪增強免疫、抗腫瘤、抗氧化作用的活性成分，在黃芪的質量評價中不宜忽視。因此，本研究在《中國藥典》2020年版的基礎上將芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物作為考察指標，對黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片的化學成分進行比較。同時，基于黃芪甲苷、黃芪多糖、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷均具有較強的抗氧化活性，故本研究對黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片的體外抗氧化活性加以比較，進一步闡明黃芪趁鮮切制工藝的可行性，為黃芪產地加工工藝提供科學指導，為不同加工方法所得黃芪飲片質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型系列高效液相色譜儀、ELSD蒸發光散射檢測器，美國Agilent公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S28s型數顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠；HX502T型電子分析天平，慈溪市天東衡器廠；766-6型遠紅外輻射干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；LFP-500A型粉碎機，上海菲力博實業公司；3SHB-3型循環水多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；L2-5K型離心機，湖南可成儀器設備有限公司；UV-power型紫外分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；A1111型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SW22型恒溫水浴振蕩器，上海巴玖實業有限公司。

1.2 試藥

3批黃芪藥材采自甘肅岷縣，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的新鮮根，將黃芪藥材按不同產地加工方式處理，干燥、粉碎后過4號篩，置于干燥器中，備用。

對照品黃芪甲苷（批號PS010428，質量分數≥98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號PS000687，質量分數≥98%）、芒柄花苷（批號PS000674，質量分數≥98%）、毛蕊異黃酮（批號PS010251，質量分數≥98%）、-葡萄糖（批號PS020418，質量分數＞98%）均購自成都普思生物科技有限公司；甲醇（批號20200302）、甲酸（批號20171201）；正丁醇（批號20190801）、氨水（批號20200706）均購自天津大茂化學試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（批號S21J11M116469）、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（批號A02GS143434）均購自上海源葉生物科技有限公司；FeSO4，批號20191101，購自煙臺市雙雙化工有限公司；水楊酸，批號20210212，購自天津市風船化學試劑科技有限公司；過硫酸鉀，批號20201120，購自天津市凱通化學試劑有限公司；水為娃哈哈純水。

2 方法與結果

2.1 不同加工處理方式制備黃芪飲片

2.1.1 黃芪趁鮮切制飲片的制備 黃芪趁鮮切制飲片工藝制備方法采用課題組前期優選出來的工藝進行制備[8]。將剛采挖的黃芪藥材除去雜質及非藥用部位，晾曬至含水量為50%，進行發汗和揉搓處理，發汗時長3 d（普通發汗法），揉搓次數2次，每次時長5 min，2項操作交替進行，清洗、切制，將切制所得飲片置于遠紅外輻射干燥箱中，飲片鋪設厚度約為1.0～1.5 cm，51 ℃條件下干燥，最終得到黃芪趁鮮切制飲片。

2.1.2 黃芪傳統飲片的制備 將黃芪藥材晾曬至一定程度（含水量約為40%），揉搓2次（每次揉搓完成后晾曬1 d），洗去表面雜質，切制、曬干，得到黃芪傳統飲片。

2.2 黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片外觀性狀的比較

中藥飲片外觀性狀在一定程度上能反映其內在質量，本研究發現，黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統飲片性狀均符合《中國藥典》2020年版規定，呈類圓形或橢圓形的厚片（2～4 mm），外表皮黃白色至淡棕褐色，可見縱皺紋或縱溝。切面皮部黃白色，木部淡黃色，有放射狀紋理及裂隙，但黃芪趁鮮切制飲片較黃芪傳統飲片外表皮及切面顏色均加深，其原因可能與黃芪趁鮮切制飲片發汗過程有密切關系。

2.3 HPLC-蒸發光散射檢測（ELSD）法測定黃芪甲苷含量

2.3.1 色譜條件 色譜柱為HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（40∶60）為流動相，等度洗脫；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣體積10 μL；蒸發光檢測器：漂移管溫40 ℃，載氣體積流量1.5 mL/min。黃芪甲苷對照品及黃芪樣品的HPLC圖見圖1。

圖1 黃芪甲苷對照品 (A) 和黃芪樣品 (B) 的HPLC- ELSD圖

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品25.00 mg于10 mL量瓶中，加甲醇超聲使其完全溶解，制成質量濃度為2.5 mg/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取各樣品粉末約4 g，精密稱定，加甲醇40 mL，回流提取1 h，抽濾，重復以上操作2次，合并濾液，減壓濃縮后加10 mL水溶解，加40 mL水飽和的正丁醇萃取，重復操作2次，合并萃取液并加入40 mL氨試液萃取，重復操作2次；將萃取液轉移至圓底燒瓶中，減壓濃縮，加甲醇定容至5 mL量瓶中，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取黃芪甲苷對照品儲備液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mL至2 mL量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度。每個不同質量濃度的對照品溶液按“2.3.1”項下色譜條件進樣10 μL測定峰面積，對不同質量濃度的對照品溶液和峰面積求自然對數，以進樣量的對數為橫坐標（），峰面積對數為縱坐標（）進行線性回歸，繪制標準曲線，求得線性方程為＝1.680 7＋2.166 1，2＝0.999 5，表明黃芪甲苷在3.771～11.313 μg線性關系良好。

2.3.5 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗穩定性、重復性、精密度、加樣回收率進行考察，其RSD值均分別為1.77%、1.35%、1.68%、1.17%，平均加樣回收率為97.00%。

2.3.6 樣品含量測定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號篩）4 g，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.3.1”項下色譜條件測定，計算黃芪甲苷含量。

2.4 HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷含量

2.4.1 色譜條件 色譜柱為HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣體積5 μL；流動相為乙 腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～20 min，20%～40%乙腈；20～30 min，40%乙腈。混合對照品及黃芪樣品HPLC圖見圖2。

圖2 混合對照品 (A) 和黃芪樣品(B) 的HPLC-DAD圖

2.4.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品10.11 mg、毛蕊異黃酮對照品4.98 mg、芒柄花苷對照品3.30 mg分別定容至10 、5 、10 mL量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度，制成質量濃度分別為1.011、0.996、0.330 mg/mL的對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液0.08、0.07、0.15 mL至10 mL量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取黃芪樣品粉末約2 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇40 mL，加熱回流1 h，抽濾，濾渣加40 mL甲醇回流提取1 h，合并2次所得濾液，于旋轉蒸發儀減壓濃縮并用色譜甲醇定容至5 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.4.4 線性關系考察 分別取“2.4.2”項下各對照品溶液，體積為0.05、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液于2 mL量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度；體積為0.03、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL的毛蕊異黃酮對照品溶液于2 mL量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度；體積為0.1、0.3、0.7、0.9、1.3、1.7 mL的芒柄花苷對照品溶液于2 mL量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度。按照“2.4.1”項下色譜條件進行檢測，進樣量5 μL。以峰面積為縱坐標（），進樣質量濃度為橫坐標（），繪制標準曲線，計算回歸方程，結果分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷＝19 079－26.369，2＝0.999 7，線性范圍25.28～303.30 μg/mL；毛蕊異黃酮＝26 723－38.364，2＝0.999 7，線性范圍14.94～149.40 μg/mL；芒柄花苷＝14 485－12.39，2＝0.999 8，線性范圍16.50～280.50 μg/mL；結果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷在相應質量濃度間線性關系良好。

2.4.5 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗進行方法學考察，得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷穩定性的RSD在0.97%～1.13%，重復性的RSD在1.15%～2.38%，精密度的RSD在0.97%～2.16%。平均加樣回收率分別為98.00%、97.00%、97.00%，RSD分別為0.79%、1.89%、1.15%。

2.4.6 樣品含量測定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號篩）2 g，分別按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.4.1”項下色譜條件測定，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷含量。

2.5 總多糖含量測定[11]

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取-葡萄糖對照品0.042 g，加純水定容至100 mL，搖勻，制得含-葡萄糖0.42 mg/mL的對照品溶液。分別取3、4、5、6、7、8 mL上述對照品溶液定容至50 mL，得到不同質量濃度的對照品溶液，待測。

2.5.2 供試品溶液的制備 取各樣品粉末約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100 mL回流提取1 h，離心，取沉淀重復上述操作1次，合并上清液，濃縮至適量，轉移至100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取5 mL，加乙醇26 mL，渦旋使混勻，離心，取沉淀加水溶解并置于250 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，待測。

2.5.3 顯色及測定 取不同質量濃度對照品溶液及供試品溶液各2 mL置于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，充分混勻，再加入5 mL濃硫酸，混勻，于40 ℃水浴鍋加熱15 min后取出，冷卻，采用紫外分光光度計于490 nm測定吸光度（）值。

2.5.4 線性關系考察 精密吸取“2.5.1”項下不同濃度的對照品溶液各2 mL置于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，充分混勻，再加入5 mL濃硫酸，混勻，于40 ℃水浴鍋加熱15 min后取出，水浴冷卻，采用紫外分光光度計于490 nm測定值。以質量濃度為橫坐標（），值為縱坐標（），繪制葡萄糖標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程＝0.014 8－0.045 9，2＝0.999 5，結果表明，在25.2～67.2 μg/mL內，葡萄糖對照品的檢測質量濃度與值呈良好的線性關系。

2.5.5 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗穩定性、重復性、精密度、加樣回收率進行考察，RSD分別為2.93%、2.63%、0.94%、1.60%，平均加樣回收率為95.90%。

2.5.6 樣品含量測定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號篩）2 g，分別按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.5.3”項下方法處理，測定值并計算總多糖含量。

2.6 總黃酮含量測定

2.6.1 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.50 mg，加70%乙醇定容至100 mL量瓶中，制成含0.025 mg/mL毛蕊異黃酮葡糖糖苷的對照品溶液；分別吸取上述對照品溶液1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中并定容至刻度，采用紫外分光光度計于260 nm下測定值。

2.6.2 供試品溶液的制備 取黃芪粉末約0.3 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，稱定總質量后超聲提取（500 W、50 Hz）30 min，稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，抽濾，取續濾液2 mL定容至10 mL量瓶中，于260 nm下測定值。

2.6.3 線性關系考察 精密吸取“2.6.1”項下不同質量濃度的對照品溶液，采用紫外分光光度計于260 nm測定值。以質量濃度為橫坐標（），值為縱坐標（），繪制毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程＝0.051 3＋0.031 3，2＝0.999 8，結果表明，在2.5～15.0 μg/mL葡萄糖對照品的檢測質量濃度與值呈良好的線性關系。

2.6.4 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗穩定性、重復性、精密度、加樣回收率進行考察，RSD分別為2.84%、0.95%、0.12%、0.73%，平均加樣回收率為98.10%。

2.6.5 樣品含量測定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號篩）2 g，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，測定值并計算總黃酮含量。

2.7 浸出物含量測定

依據《中國藥典》2020年版第四部水溶性浸出物測定法（通則2201）項下冷浸法測定。

2.8 綜合評分計算[12-13]

熵權法是一種根據多項指標所提供的信息來確定各指標權重的客觀賦權法。信息熵作為體系混亂程度的度量，指標熵值越小，則它所蘊涵的信息量越大，在綜合評價中所起作用也越大，其權重也應越高，具體計算方法如下。

①利用公式（1）進行數據歸一化處理。

X′＝(X－min)/(max－min) （1）

為第個指標下第組的含量，max為每個指標下測得的含量最大值，min為每個指標下測得的含量最小值

②采用公式（2）、（3）定義信息熵（E）。

P為第個指標下第組的概率，且0≤P≤1；E為各指標的信息熵，當P＝0時，lnP無意義，故當P＝0時，將lnP修正為0

③利用公式（4）計算指標的熵權系數（w）。

w為熵權系數，且0≤w≤1

課題組在前期預試驗中[8-9]，應用熵權法計算得到黃芪甲苷質量分數（1）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量分數（2）、芒柄花苷質量分數（3）、毛蕊異黃酮質量分數（4）、總黃酮質量分數（5）、總多糖質量分數（6）、水溶性浸出物質量分數（7）的w分別為0.157、0.138、0.234、0.117、0.163、0.121、0.069，則綜合評分（）＝1×0.157＋2×0.138＋3×0.234＋4×0.117＋5×0.163＋6×0.121＋7×0.069。

2.9 基于化學計量學方法的黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片的比較

將“1.2”項下的3批黃芪藥材采用傳統加工工藝和趁鮮切制加工工藝進行產地加工，得到傳統組1～3（T1～T3）和趁鮮切制1～3（Q1～Q3）共6組黃芪飲片，分別按照“2.3”～“2.7”項方法測定6組黃芪飲片中各指標成分含量并計算其質量分數（1～7），按照“2.8”項方法計算不同試驗組別中各指標成分的綜合評分（），結果見表1。

為進一步比較黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片間的差異，尋找不同加工方式對黃芪化學成分的影響，本研究采用化學計量學方法，以7個指標性成分的含量為變量，對黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片進行分析。

表1 黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片指標性成分的綜合評分比較

2.9.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 采用SIMCA 14.1統計學軟件對3批黃芪趁鮮切制飲片Q1～Q3與3批傳統飲片T1～T3進行PCA，得分矩陣圖見圖3，模型參數2值及預測能力參數2值分別為0.704、0.731。結果顯示6批黃芪樣品可被分為2組，其中黃芪趁鮮切制飲片（Q1～Q3）為1組，黃芪傳統飲片（T1～T3）為1組，結果表明黃芪趁鮮切制飲片加工工藝與黃芪傳統加工工藝具有一定差異。

2.9.2 偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 為了進一步區分不同加工方式對黃芪飲片及尋找差異成分，在經過PCA基礎上，本研究進一步采用PLS-DA對黃芪趁鮮切制飲片Q1～Q3與傳統飲片T1～T3進行分析。以7個指標性成分的含量作為輸入變量得到相應模型，結果見圖4、5。建立的PLS-DA模型中，累積解釋能力參數2和2分別為0.817和0.984，預測能力參數2為0.956，2和2均大于0.5，表明所建模型具有一定的穩定性及可靠性，可用于評價和區分不同加工方式所得黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片。同時，研究結果發現PLS-DA得分圖與PCA結果相似，不同加工方式所得黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片被很好地分為2類。

圖3 黃芪不同加工方式飲片PCA圖

圖4 黃芪不同加工方式飲片PLS-DA圖

圖5 黃芪不同加工方式飲片PLS-DAVIP值

根據模型中變量權重要性排序（VIP）預測值來篩選出具有統計學意義的差異成分，在95%的置信區間，選出VIP＞1.0的變量作為差異化合物，芒柄花苷、總多糖、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的VIP值分別為1.168、1.162、1.158、1.072，因此確定芒柄花苷、總多糖、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷為不同加工方式所得黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片的差異性化合物，可以作為區分和評價黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片的指標性成分。

2.10 黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片體外抗氧化活性比較

2.10.1 溶液的制備 精密稱定黃芪傳統飲片組T1、趁鮮切制飲片組Q1樣品粉末1 g，置于圓底燒瓶中，加水100 mL，提取1 h，重復上述操作1次，合并上清液，濃縮至適量，轉移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，制得質量濃度為100 mg/mL的母液，4 ℃保存。

使用維生素C（VC）作為陽性對照組，其系列質量濃度分別為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL。

2.10.2 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基清除實驗常用于評價植物中化合物的自由基清除力[14]。本實驗參考薛志遠[3]研究方法并在其基礎上稍作修改。精密稱取20 mg DPPH，加甲醇使其溶解并定容至250 mL量瓶中，使其成為0.2 mmol/L反應溶液，避光，4 ℃保存，備用。將“2.10.1”項下取提前配制好的母液加水稀釋成相當于原生藥材的系列質量濃度溶液（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL），將不同質量濃度的藥材溶液及DPPH反應溶液各取2 mL并加入同一試管中混勻，于避光處反應30 min，測其在517 nm波長的值，記錄為A，測定0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL與2 mL甲醇試劑混合后的值，記為c；2 mL提取物與2 mL甲醇溶液混合后的值，記為A；重復3次[15]。

DPPH自由基清除率＝1－(A－A)/c

如圖6所示，黃芪原生藥材質量濃度為0.625 mg/mL時，黃芪趁鮮切制組與傳統組對DPPH自由基的清除能力較低，而隨著黃芪原生藥材質量濃度的不斷升高，其提取物對DPPH自由基的清除率具有劑量依賴性，當黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統組原生藥材質量濃度從0.625 mg/mL上升到10.000 mg/mL時，對DPPH自由基的清除能力分別迅速上升到77.18%和70.25%。此后，隨著黃芪原生藥材質量濃度的增加，對DPPH自由基的清除率增加緩慢，黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統組別的IC50分別為5.560、8.168 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制組較黃芪傳統組DPPH自由基清除力強。而陽性對照組質量濃度為0.625 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率已經達到93.81%。此后，隨著質量濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率無明顯變化。

圖6 黃芪總提取物對DPPH自由基的清除能力

2.10.3 羥基自由基清除能力的測定 羥基自由基對生物體有較強的毒性，也常用于評價植物提取物體外抗氧化活性研究[16]，羥基自由基所致損害引起廣泛關注[17]。本實驗參考Chen等[18]的研究方法并稍作修改。羥基自由基反應液：1 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）＋2 mL水楊酸-無水乙醇溶液（9 mmol/L）。將“2.10.1”項下提前配置的母液加水稀釋成相當于原生藥材的系列質量濃度溶液（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL），取不同質量濃度的藥材溶液2 mL、9 mmol/L H2O2反應液1 mL及羥基自由基3 mL加入同一試管中混合均勻后37 ℃反應30 min，測其在510 nm波長的值，記錄為A；測羥基自由基3 mL、9 mmol/L H2O2反應液1 mL及2 mL雙蒸餾水混合后的值，記為c；2 mL提取液、羥基自由基3 mL及雙蒸餾水1 mL混合后的值，記為A；重復3次。

羥自由基清除率＝1－(A－A)/A

如圖7所示，當黃芪原生藥材質量濃度為0.625～5.000 mg/mL，黃芪趁鮮切制組與傳統組對羥基自由基的清除能力較低，而隨著黃芪原生藥材質量濃度的逐漸增加，其提取物對羥基自由基的清除率也隨之增加，并呈上升趨勢，當黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統組原生藥材質量濃度上升到10.000 mg/mL時，對羥基自由基的清除能力迅速上升到46.242%和40.494%。此后，隨著黃芪原生藥材質量濃度的增加，對羥基自由基的清除率增加緩慢，黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統組的IC50分別為10.994、15.045 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制組較黃芪傳統組羥基自由基清除力強。而陽性對照組質量濃度從0.625 mg/mL開始，對羥基自由基的清除率迅速升高，當其質量濃度為10.000 mg/mL時，對羥基自由基的清除率達到97.244%。此后，隨著質量濃度的增加，其對羥基自由基的清除率無明顯變化，其IC50＝3.572 mg/mL。

2.10.4 ABTS自由基清除能力的測定 Miller等[19]于1993年首次介紹了通過清除ABTS來評價物質的抗氧化能力的方法，根據待測物對ABTS自由基的清除能力，采用傳統分光光度法進行測定，進而對其抗氧化活性大小進行評價，本實驗參考Souza等[20]的方法并稍作修改。將5 mL質量濃度為2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液與7 mmol/L ABTS溶液充分混勻，在4 ℃、避光條件下靜置12～16 h，3～4 d內使用，使用前取1 mL混合液，加入超純水稀釋，使得溶液在734 nm下值為0.7±0.2。將“2.10.1”項下母液加水稀釋成相當于原生藥材的系列質量濃度溶液（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL），取不同質量濃度的藥材溶液0.1 mL，加入3.9 mL ABTS反應液，搖勻，室溫下避光反應7 min，在734 nm處測定值，記為1；以3.9 mL水代替3.9 mL ABTS反應液測定值，記作2；空白對照中的樣品溶液用水代替，記為0；VC作陽性對照[21]。

圖7 黃芪總提取物對羥基自由基的清除能力

ABTS自由基清除率＝1－(1－2)/0

如圖8所示，黃芪原生藥材質量濃度為0.625 mg/mL時，黃芪趁鮮切制組與傳統組對ABTS自由基的清除能力較低。隨著黃芪原生藥材質量濃度的不斷升高，其提取物對ABTS自由基的清除率具有劑量依賴性，黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統組原生藥材質量濃度在0.625～20.000 mg/mL，對ABTS自由基的清除能力上升較快，當黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統組原生藥材質量濃度大于20.000 mg/mL后，分別迅速上升到77.18%和70.25%。此后，隨著黃芪原生藥材質量濃度的增加，對ABTS自由基的清除率增加緩慢；黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統組別的IC50分別為8.126、14.546 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制組較黃芪傳統組ABTS自由基的清除力強。而陽性對照組質量濃度為0.065 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率已經達到95.188%。此后隨著質量濃度的增加，其對ABTS自由基的清除率無明顯變化。

圖8 黃芪總提取物對ABTS自由基的清除能力

3 討論

黃芪藥材產地加工在其品質形成過程中發揮重要作用，本研究以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物為指標，通過熵權綜合評分法比較2種不同加工方式對黃芪飲片質量的影響，發現黃芪趁鮮切制飲片及傳統飲片在化學成分上具有一定差異，整體表現為黃芪趁鮮切制飲片質量優于傳統飲片。但在黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片的化學成分比較結果中，黃芪趁鮮切制組與傳統組組內同一指標出現較大差異，其主要原因在于不同產地黃芪藥材質量具有一定差異；此外，由于本研究僅在實驗室中進行，切制過程手工完成，切片厚度也可能是組內同一指標出現較大差異的另一重要原因。同時，本研究為了更好地辨識不同加工方式對黃芪飲片質量的影響，采用PCA和PLS-DA，將黃芪趁鮮切制飲片與傳統飲片分為2類，篩選出了4個差異化合物，分別是芒柄花苷、總多糖、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，可作為區分和鑒別不同加工方式的黃芪飲片質量的控制指標。同時，黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統飲片體外抗氧化結果表明：DPPH自由基清除能力的IC50分別為5.560、8.168 mg/mL；羥基自由基清除能力的IC50分別為10.994、15.045 mg/mL；ABTS自由基清除能力的IC50分別為8.126、14.546 mg/mL。上述實驗數據表明，黃芪趁鮮切制工藝能在一定程度上避免其化學成分的損失，保證黃芪飲片質量。

此外，本課題組前期研究中發現，黃芪趁鮮切制工藝與傳統工藝加工所得飲片質量存在差異，并優選出最佳加工工藝參數。在此基礎上，本研究從化學成分和體外抗氧化活性角度對2種不同加工方法所得飲片質量比較，結果表明黃芪趁鮮切制飲片綜合質量優于黃芪傳統飲片。因此，黃芪趁鮮切制飲片質量標準應在黃芪傳統飲片的基礎上加以完善，為推廣黃芪趁鮮切制飲片加工工藝及其質量控制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on chemical composition andanti-oxidant activity offresh-cut pieces and traditional pieces

WU Hong-wei1, 2, LI Dong-hui1, 2, SONG Qin-jie1, 2, LI Guo-feng1, 2, LI Xian-wei1, 2, YANG Xin-rong1, 2, LI Yue-feng1, 2, 3

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Standard and Quality of Chinese Medicine Research of Gansu, Lanzhou 730000, China 3. Gansu Engineering Research Center for Chinese Medicine Pharmaceutical Technology, Lanzhou 730000, China

HPLC, UV and other methods were used to determine and compare the index components andantioxidant activities of fresh-cut pieces and traditional pieces of Huangqi (), providing scientific basis for quality control ofpieces with different processing methods.HPLC, UV and other methods were used to determine the contents of 7 index components (astragaloside IV, calycosin-7-glucoside, ononin, calycosin, total flavonoids, total polysaccharides, water-soluble extract) in fresh-cut and traditional pieces of. The effect of different processing methods on the quality ofwas evaluated by the entropy weight method combined with technique for order preference by similarity to an ideal solution (TOPSIS). In addition, chemometric methods such as principal component analysis (PCA) and partial least squares- discriminant analysis (PLS-DA) were used to differentiate and compare the fresh-cut pieces ofwith the traditional pieces of. At the same time, DPPH free radical, hydroxyl free radical and ABTS radical scavenging ability were used as evaluation indexes to compare theantioxidant activity of fresh-cut pieces ofand traditional pieces of.The entropy weight comprehensive score method was used to compare the effects of two different processing methods on the quality ofdecoction pieces. The results showed that the comprehensive score of fresh-cutdecoction pieces was higher than that of traditionaldecoction pieces.antioxidant activities ofin the fresh-cut group and the traditional group were 5.560, 8.168 mg/mL for IC50of DPPH radical scavenging capacity, the IC50of hydroxyl radical scavenging capacity was 10.994, 15.045 mg/mL, and the IC50of ABTS radical scavenging capacity was 8.126, 14.546 mg/mL, respectively. The above results showed that theantioxidant activity of fresh-cut pieces ofwas stronger than that of traditional slices of.In this study, the entropy weight TOPSIS comprehensive scoring method combined with chemometrics analysis method andantioxidant activity were used to analyze the fresh-cut slices and traditional slices of, so as to provide reference for the quality control ofslices with different processing methods.

; producing area processing;antioxidant; chemical pattern recognition analysis; quality control;astragaloside IV; calycosin-7-glucoside; ononin; calycosin; total flavonoids; total polysaccharides; water-soluble extract

R283.6

A

0253 - 2670(2022)22 - 7039 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.007

2022-05-23

國家自然科學基金資助項目（81960713）；國家自然科學基金資助項目（82160750）；基礎研究創新群體項目（21JR7RA569）；甘肅省教育廳產業支撐計劃項目（2021CYZC-21）；甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心開放課題（ZYGY202003）；國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室項目（2020GSMPA-KL15）；甘肅省高等學校產業支撐計劃項目——四種道地隴藥綠色規范化產業發展示范推廣（2020C-09）；民生科技專項（科技特派員專題）——中藥材引種馴化與道地藥材產業化扶貧示范推廣（20CX9 NA070）；甘肅省科學技術廳——科技計劃（創新基地與人才計劃）雙一流科研重點項目（GSSYLXM-05）；甘肅省中藥炮制技術傳承基地項目

吳紅偉，男，碩士研究生，研究方向為中藥及復方加工炮制機制及活性成分研究。Tel: 13519317036 E-mail: 2419161734@qq.com

李越峰，女，教授，博士生導師，研究方向為中藥及復方加工炮制機制及活性成分研究。E-mail: lyfyxk@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]