傳統工藝山西陳醋釀造微生物溯源分析

寇 蓉，馮國楊，李 晨，范曉軍

（1.太原理工大學生物醫學工程學院，山西 晉中 030600；2.山西杏花村汾酒集團有限責任公司，山西 汾陽 032205；3.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006；4.太原理工大學 環境科學與工程學院，山西 晉中 030600）

傳統山西陳醋釀造過程是在開放的環境中進行[1-2]，盡管原料高粱需要進行蒸煮處理，但在操作過程中極易從操作工具、車間空氣、車間地面等環境中引入微生物，這些微生物在富含營養的醋醅基質中生長代謝和繁衍，在一定程度上影響著食醋風味和釀造的穩定性[3]。先前的研究主要對食醋釀造發酵劑進行了大量研究[4-6]，而在生產實踐中不同車間釀造的食醋品質往往存在差異，這表明車間環境中的微生物可能會參與到食醋的釀造過程中，進而影響食醋的品質。此外，火醅作為醋酸發酵的引子[7]，其對食醋釀造微生物的影響仍缺乏針對性研究。山西陳醋釀造過程中在醋酸發酵階段加入生料麩皮，既增加了醋醅的疏松度，促進氧氣的傳遞[8]，也為醋酸發酵提供了重要的營養物質。生料麩皮的添加是否同時會向釀造系統中引入某些微生物，這一問題值得深入探討。

微生物溯源方法的建立使復雜微生物系統的菌群來源分析成為可能，也促進了研究者對食品釀造過程中微生物來源的解析。如WANG等[9]采用SourceTracker確定了大曲和環境微生物對我國谷物發酵白酒中微生物群落的貢獻，其中，發酵過程中的好氧菌和兼性厭氧菌主要來源于大曲，而厭氧菌主要來源于窖泥。2019年提出的快速期望最大化微生物源跟蹤（FEAST）方法比SourceTracker方法具有更高的精度和更快的速度[10]，該方法已經廣泛地應用于土壤[11]、醫學[12-15]、污泥[16]等領域微生物的溯源分析。

本研究以山西陳醋釀造發酵劑、車間環境微生物、輔料麩皮和發酵醅為研究對象，利用高通量測序技術研究微生物群落的結構和多樣性，并采用FEAST方法解析了發酵劑、車間環境、操作工具、末期酒醅、輔料麩皮和火醅中的微生物對食醋釀造過程微生物組成的貢獻，對深入認識食醋釀造過程和發酵過程控制都具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料發酵劑、車間環境和操作工具微生物樣品、輔料麩皮和發酵醅樣品均取自山西清徐縣某醋廠。大曲（Daqu）、快曲（Kuaiqu）和麩皮（Bran）分別取自曲房和輔料室，Quick Take 30空氣微生物采樣器放置于發酵車間內工作7 d，用于采集車間空氣中的微生物（Air）。工具表面（Tools）（如鐵锨、笤帚等）、車間地面（InG）和室外地面（OutG）的微生物采用浸有0.1 mol/L PBS緩沖液的無菌棉擦拭獲取[17]。發酵醅樣品取同一批次淀粉糖化（starch saccharification，Sac）發酵第2天樣品（編號Sac2）、酒精發酵（alcohol fermentation，AF）第12天樣品（編號AF12）、醋酸發酵（acetic acid fermentation，AAF）第1天樣品（編號AAF1）和前批次醋酸發酵第3天樣品（編號AAF3）。糖化和酒精發酵階段樣品取自發酵池的頂部、中部和底部，混合后得到測試樣；醋酸發酵階段樣品在距離發酵池表面30 cm的深度進行東西南北中五點采集，混合均勻后作為醋酸發酵階段的測試樣。樣品用無菌密封袋封裝，-20℃保存備用。

1.1.2 試劑酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、50×TAE緩沖液、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）裂 解液、溶菌酶：上海生工生物工程股份有限公司；DNA聚合酶、緩沖液：美國NEB公司；GeneJET膠回收試劑盒：美國Thermo Fisher Scientific公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京市水光明醫療儀器有限公司；Neofuge 15R高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；NanoVue plus超微量紫外分光光度 計：英 國Cytiva公 司；T100梯 度PCR儀：美 國Bio-Rad公司；Novaseq6000高通量測序平臺：美國Illumina公司；Quick Take 30空氣微生物采樣器：美國SKC公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組提取與檢測采用CTAB法[18]對醋醅樣本的微生物宏基因組進行提取，操作如下：（1）吸取1 000 μL CTAB裂解液至2.0 mL EP管里，加入20 μL溶菌酶，將適量的樣品加入裂解液中，65℃水浴（時間為2～3 h），期間顛倒混勻數次，以使樣品充分裂解。（2）離心取950 μL上清，加入與上清等體積的酚（pH值8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。（3）取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。（4）吸取上清至1.5 mL離心管里，加入上清液3/4體積的異丙醇，上下搖晃，-20℃沉淀。（5）12 000 r/min離心10 min，倒出液體。用1 mL體積分數為75%乙醇洗滌2次，剩余的少量液體可再次離心收集，然后用槍頭吸出。（6）超凈工作臺吹干或者室溫晾干。（7）加入51 μL ddH2O溶解DNA樣品。（8）加RNase A 1 μL消化核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），37℃放置15 min。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性并用超微量分光光度計測定DNA的濃度與純度。

1.3.2 PCR擴增與高通量測序用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）、806R（5'-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和 引 物ITS3-2024F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）、ITS4-2409R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3'）分 別 擴 增 細 菌16S rRNA基 因V4區 和 真 菌ITS2區。PCR擴 增 體 系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，引物各1.5 μL，基因組DNA（genomic DNA,gDNA）10 μL，H2O 2 μL。PCR擴增條件：98℃預變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30個循環；72℃再延伸5 min。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，高通量測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.3.3 高通量測序數據分析測序原始序列通過序列拼接、過濾、質量控制、去除嵌合體，最終獲得有效序列[19-22]。利用Uparse算法（Uparse v7.0.1001）以97%的一致性將所有樣本的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[23]。使用Mothur軟件與SILVA（v138.1）數據庫對細菌OTUs序列進行物種注釋分析，應用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與Unite（v8.2）數據庫對真菌OTUs序列進行物種注釋分析，并分別在門、綱、目、科、屬水平上統計各樣本的群落組成。對以上各樣本數據進行均一化處理，用于后續Alpha多樣性分析。

1.3.4 FEAST溯源分析FEAST溯源分析通過網站（https://github.com/cozygene/FEAST）提供的R語言在RStudio程序中運行完成。傳統工藝山西陳醋是通過高溫蒸料糊化后加入發酵劑進行糖化和酒精發酵，酒精發酵結束后將酒醅與輔料麩皮混合，并將前批次醋酸發酵第3天的醋醅（俗稱火醅）作為種子發酵劑引入到新批次的醋酸發酵階段。因此，本研究也將火醅微生物納入到醋酸發酵第1天的微生物來源分析當中。此外，釀造車間環境中的微生物經過長時間的積淀，其菌群組成對食醋發酵過程也有著重要的影響。本研究針對山西陳醋釀造微生物的溯源分析分2個部分，其一以發酵劑（大曲和快曲）和車間環境微生物（車間空氣、車間地面、工具表面、室外地面）種群為源端，糖化發酵第2天微生物種群為接受端進行溯源分析；其二以酒精發酵第12天的酒醅、輔料麩皮、車間環境微生物（車間空氣、車間地面、工具表面、室外地面）和火醅種群為源端，醋酸發酵第1天微生物種群為接受端進行溯源分析。

1.4 數據分析

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-OTUs、Shannon、Chao1及Coverage指 數。利 用Origin 8.5軟件繪制稀釋曲線和門水平、屬水平物種相對豐度柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 樣品測序數據分析

基于高通量測序技術對發酵劑、車間環境微生物樣品、輔料麩皮和發酵醅樣品中細菌和真菌的有效序列和OTUs進行研究，結果如表1所示。

表1 樣品中細菌和真菌的序列信息Tab.1 Sequence information of bacteria and fungi in samples

11個樣品共產生706 931條細菌有效序列、673 733條真菌有效序列。將有效序列以97%的一致性聚類成為OTUs，結果發現，空氣中細菌OTU最多，有1 487個；麩皮中真菌OTU最多，有462個；糖化發酵第2天樣品中細菌OTU最少，有464個；大曲中真菌OTU最少，有60個。所有樣品中細菌OTUs均大于真菌OTUs，說明發酵劑、車間環境微生物樣品、輔料麩皮和發酵醅樣品中細菌群落多樣性遠高于真菌群落，大曲中的微生物種類更為鮮明和集中。

2.2 醋醅樣品Alpha多樣性分析

稀釋曲線直接反映測序數據量的合理性，山西陳醋釀造發酵劑、車間環境微生物、輔料麩皮以及發酵醅的微生物測序稀釋曲線如圖1所示。山西陳醋釀造發酵劑、車間環境微生物、輔料麩皮以及發酵醅樣品中微生物的Alpha多樣性指數結果如表2所示。

表2 樣品中細菌和真菌群落Alpha多樣性指數Tab.2 Alpha diversity indexes of bacterial and fungal community in samples

圖1 樣品中細菌（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of bacteria（a）and fungi（b）in samples

由圖1可知，所有樣品的稀釋曲線漸近平坦并且Coverage指數均＞0.99，表明測序可以反映各樣本中絕大多數微生物群落特征和多樣性信息。

Shannon指數和Chao1指數分別為多樣性指數和豐富度指數。其中，Shannon指數用于表征微生物群落內物種分布的多樣性和均勻度。微生物群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數越大。Chao1指數用于估計微生物群落中包含的物種總數，微生物群落豐富度越高，Chao1指數越大。由表2可知，所有樣本細菌群落的多樣性和豐富度均大于真菌群落。在瀘州酒中溫大曲和山西老陳醋大曲中也檢測到細菌群落的豐富度和多樣性高于真菌群落[24-25]?？諝庵屑毦郝涞亩鄻有院拓S富度最高，真菌群落的豐富度最高，在清香類型白酒發酵車間微生物的研究中也檢測到空氣中細菌群落的多樣性高于其他環境樣品[17]。這些空氣中豐富的微生物為食醋釀造提供了充足的微生物資源，也是地域生態特征的重要體現。此外，麩皮中真菌群落的多樣性最高；大曲中真菌群落的多樣性和豐富度最低；快曲中細菌群落的多樣性最低；Sac2中真菌群落的豐富度最低。

2.3 微生物群落結構分析

基于門水平發酵劑、車間環境微生物、輔料麩皮以及發酵醅中的細菌和真菌群落結構分析，結果如如圖2所示。由圖2可知，大曲和麩皮中變形菌門（Proteobacteria）是優勢細菌門，其余樣本中硬壁菌門（Firmicutes）是優勢細菌門。王佳麗[25]對山西老陳醋大曲的研究結果顯示，硬壁菌門（Firmicutes）是主要的細菌門；王雪山[17]對清香類型白酒使用的中溫大曲研究發現，成品曲硬壁菌門（Firmicutes）占主導，新曲中變形菌門（Proteobacteria）占主導地位，這些研究結果產生差異的原因可能是取樣季節、大曲儲存時間以及大曲發酵過程中水活度、酸度、溫度等發酵微環境因素對微生物的自然篩選作用導致的[26]。麩皮中擔子菌門（Basidiomycota）是優勢真菌門，其余樣本中子囊菌門（Ascomycota）是優勢真菌門。

圖2 基于門水平各樣品中細菌（a）和真菌（b）群落結構分析Fig.2 Community structure analysis of bacterial（a）and fungal（b）in samples based on phylum level

基于屬水平山西陳醋釀造發酵劑、車間環境微生物、輔料麩皮以及發酵醅樣本中的細菌和真菌群落結構分析，結果如圖3所示。由圖3可知，車間環境（工具表面、車間地面、車間空氣和室外地面）、醋酸發酵第1天樣品和火醅樣本中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是主要的細菌屬。糖化發酵第2天樣品和酒精發酵第12天樣品中主要的細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和Limosilactobacillus。大曲中優勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其相對豐度僅為3.68%?？烨袃瀯菁毦鷮贋槲核故暇鷮伲╓eissella），相對豐度達69.59%。不動桿菌屬（Acinetobacter）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）是麩皮中主要的細 菌屬。

圖3 基于屬水平各樣品中細菌（a）和真菌（b）群落結構分析Fig.3 Community structure analysis of bacterial（a）and fungal（b）in samples based on genus level

大曲中復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）占絕對優勢，其相對豐度達99.06%，這與Alpha多樣性指數的結果一致?？烨星箤伲ˋspergillus）和根霉屬（Rhizopus）是主要的真菌屬。糖化發酵第2天樣品、酒精發酵第12天樣品和火醅樣品中復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和酵母菌屬（Saccharomyces）是主要的真菌屬；醋酸發酵第1天樣品中主要的真菌屬為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和布氏白粉菌屬（Blumeria）。節擔菌屬（Wallemia）和絲孢菌屬（Trichosporon）是麩皮樣品中主要的真菌屬；布氏白粉菌屬（Blumeria）和酵母菌屬（Saccharomyces）是工具表面樣品中主要的真菌屬；畢赤酵母屬（Pichia）和復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）是室外地面樣品中主要的真菌屬；復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和Cercospora是室內地面樣品中主要的真菌屬；酵母菌屬（Saccharomyces）和復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）是空氣樣品中主要的真菌屬。

2.4 食醋釀造微生物溯源分析

糖化發酵第2天樣品和醋酸發酵第1天樣品中細菌和真菌群落的溯源分析如圖4所示。從圖4可以看出，在糖化發酵第2天樣本中細菌群落中有6.18%來自車間地面，3.66%來自工具表面，1.17%來自車間空氣；真菌群落中有86.66%來自大曲。醋酸發酵第1天樣本中細菌群落有13.94%來自工具表面，9.43%來自火醅，8.91%來自酒精發酵第12天的酒醅；真菌群落中有52.39%來自工具表面，31.40%來自車間空氣，8.46%來自酒精發酵第12天的酒醅。

圖4 糖化發酵第2天樣品（a）和醋酸發酵第1天樣品（b）中微生物溯源分析Fig.4 Microbial source tracking of samples on the second day of saccharification fermentation（a）and the first day of acetic acid fermentation（b）

傳統山西陳醋采用循環接種工藝，即在醋酸發酵階段開始，將火醅作為醋酸發酵第1天的種子發酵劑，本研究結果也顯示，在醋酸發酵第1天，有9.43%的細菌群落和4.02%的真菌群落來源于火醅，在保寧醋發酵過程中也表明回糟的引入極大地豐富了發酵初期醋醅中微生物的種類[27]。

盡管Alpha多樣性指數顯示，大曲中真菌群落的多樣性和豐富度最低，但是大曲對糖化發酵第2天樣品中真菌群落的貢獻達86.66%，這表明大曲中含量突出的菌種在食醋釀造中發揮了巨大的潛能。

3 結論與討論

本研究基于高通量測序技術和FEAST方法研究了山西陳醋釀造發酵劑、車間環境微生物、輔料麩皮以及發酵醅微生物的群落組成結構和多樣性以及釀造微生物的來源。結果表明，所有樣本中細菌群落的多樣性和豐富度大于真菌群落。大曲中優勢細菌屬和真菌屬分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），而快曲中優勢細菌屬和真菌屬分別為魏斯氏菌屬（Weissella）和曲霉屬（Aspergillus）。車間環境（工具表面、車間地面、室外地面和車間空氣）、醋酸發酵第1天樣品和火醅樣本中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是主要的細菌屬。FEAST結果顯示，糖化發酵第2天樣本中細菌群落主要來自車間地面和工具表面；真菌群落主要來自大曲。王雪山[17]在對新廠區和老廠區清香類型白酒發酵微生物溯源分析發現，大曲對老廠區和新廠區發酵0 d酒醅中真菌群落的貢獻大于細菌群落。這表明釀造微生態對外加微生物具有選擇性，真菌群落更易在糖化發酵第2天的發酵稀醪中生存，這可能與其相對致密的細胞壁結構有關。醋酸發酵第1天樣本中細菌群落主要來自工具表面、火醅和酒精發酵第12天的酒醅；真菌群落主要來自工具表面、車間空氣和酒精發酵第12天的酒醅。本研究首次對山西陳醋發酵微生物的來源進行了系統解析，獲得了山西陳醋釀造生態中主要的微生物源端對陳醋發酵微生物群落的貢獻，為山西陳醋釀造過程調控提供了科學的理論依據。

本研究僅討論了單個季節環境微生態數據以及山西陳醋發酵微生物的來源，而環境微生態易受季節變化的影響，進而影響食醋釀造過程。因此，以后應開展不同季節環境微生態對食醋發酵過程的影響方面的研究。