UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS分析黃連解毒湯的化學成分及大鼠組織分布

王永麗，黃廣建，劉從進，戚勝蘭，李榮勝，劉 偉,

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS分析黃連解毒湯的化學成分及大鼠組織分布

王永麗1，黃廣建3，劉從進3，戚勝蘭1，李榮勝2*，劉 偉1, 2*

1. 上海中醫藥大學 中藥研究所，上海 201203 2. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203 3. 復旦大學附屬華山醫院，上海 200040

運用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS技術實現高效、快速、精準分析鑒定黃連解毒湯的化學成分及大鼠ig后其主要成分在不同組織中的分布。色譜分離采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動相梯度洗脫，通過HRMS的正、負離子監測模式，全掃描及自動觸發二級質譜掃描功能（Full MS/dd-MS2），對黃連解毒湯中的化學成分進行快速分析及鑒定。在此基礎上，對大鼠口服黃連解毒湯后血及組織中的移行成分進行鑒定。通過化合物的一級、二級質譜信息，結合對照品比對確認與相關文獻報道分析，從黃連解毒湯中共鑒定出110種化學成分，包括36種黃酮類、28種環烯醚萜、15種生物堿、15種有機酸、5種木脂素以及11種其他類化合物。大鼠ig黃連解毒湯后，分別從血清、心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸中檢測到40、50、55、65、61、62、32、46種原型成分。根據各原型成分在原方、血清及各組織中的均一化峰面積，可知梔子新苷、黃連堿、小檗堿、巴馬汀、藥根堿、黃柏堿等成分在肝、腎等組織中有較大的暴露量。借助UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS技術系統、準確、快速地實現了黃連解毒湯化學成分鑒定，并揭示了黃連解毒湯大鼠ig給藥后主要成分的組織分布特征，為后續黃連解毒湯潛在藥效物質基礎研究及臨床應用提供參考。

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS；黃連解毒湯；組織分布；藥效物質；梔子新苷；黃連堿；小檗堿；巴馬汀；藥根堿；黃柏堿

黃連解毒湯為清熱解毒劑之代表方，出自東晉葛洪《肘后備急方》卷二，未出方名。黃連解毒湯方名始見唐代王燾《外臺秘要》卷一引《崔氏方》。其方由黃連（三兩）、黃芩（二兩）、黃柏（二兩）、梔子（十四枚，擘）四味藥材組成[1]。主治三焦實熱火毒壅盛之證。癥見大熱、狂躁錯語、不眠、目赤眼痛，或熱病出血；或外科癰瘍疔毒。臨床用于治療敗血癥、膿毒血癥、肺炎、2型糖尿病和膽道感染、阿爾茨海默病等癥[2-5]。近年來國內外在黃連解毒湯的藥理研究報道較多，研究表明黃連解毒湯具有降血壓[6]、抗心律失常、抗菌、抗炎[7]、抗動脈粥樣硬化[8]、抗內毒素[9]等廣泛的藥理活性。對黃連解毒湯全面的化學成分和組織分布的報道較少，相關研究主要集中在梔子苷、黃芩苷、小檗堿、黃柏堿及其他生物堿等成分的藥動學方面[10-12]。因此，為了全面準確地表征黃連解毒湯的化學組成和組織分布情況，解析黃連解毒湯潛在活性物質基礎，本研究借助目前較成熟的超高效液相串聯四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS）分析技術，采用正、負離子模式掃描，根據化合物保留時間、相對分子質量、二級碎片離子等信息，結合對照品比對、文獻報道、數據庫比對等方式，快速、系統的開展黃連解毒湯的化學成分與組織分布研究[13]。以期為揭示黃連解毒湯的潛在藥效物質基礎、復方的質量控制及臨床合理應用等提供部分科學依據和參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HR-MS液質聯用系統：Dionex Ultimate 3000型高壓液相色譜串聯Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；Milli-Q超純水處理系統（美國Millipore公司）；BP211D電子分析天平（DE Sartorius公司）。

1.2 藥物與試劑

奎寧酸（批號MB6731）、黃芩苷（批號D0321AS）、黃芩素（批號J0227AS）、蘆丁（批號J0509AS）購自大連美侖生物技術有限公司；咖啡酸（批號190425）、隱綠原酸（批號15020603）購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；綠原酸（批號PRF7102045）、原兒茶酸（批號PRF10061151）、原兒茶醛（批號PRF10041021）、小檗堿（批號PRF10092648）、黃連堿（批號PRF21011403）、巴馬汀（批號PRF10030643）、黃柏堿（批號PRF10031323）、小檗紅堿（批號PRF20112344）、小檗堿（批號PRF10092648）、甲基黃連堿（批號PRF10031223）、去亞甲基小檗堿（批號PRF20030224）、野黃芩苷（批號PRF10120301）、毛蕊花糖苷（批號PRF10082001）、西紅花苷I（批號PRF10071003）、西紅花苷II（批號PRF10081201）、西紅花酸（批號PRF10031207）、京尼平-1-β龍膽雙糖苷（批號PRF9051521）、羥異梔子苷（批號PRF9040843）、京尼平（批號PRF10072302）、梔子苷（批號PRF10072502）均購自成都普瑞法科技開發有限公司；以上對照品經HPLC峰面積歸一化法測定，質量分數均≥98.0%。

甲醇、乙腈、甲酸為HPLC級（美國Thermo Fisher Scientific公司）；實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水處理系統制得；黃連（批號20201201）和黃柏（批號20210501）購自江西弘康中藥飲片有限公司；黃芩（批號200401）和梔子（批號201201）購自江西順福堂中藥飲片有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

雄性健康Wistar大鼠6只，體質量（220±20）g；由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號SCXK（滬）2017-0005；飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，使用許可證號SYXK（滬）2020-0009，室內溫度為22～26 ℃，相對濕度為40%～70%，光照/黑暗時間各12 h。動物實驗通過上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號PZSHUTCM210709016）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 黃連解毒湯供試品溶液的制備 稱取黃連（90 g）、黃芩（60 g）、黃柏（60 g）、梔子（90 g），加2400 mL水浸泡30 min，煎煮60 min，紗布濾過藥液，藥材再進行第2次煎煮，加水1800 mL，煎煮45 min，濾過，合并2次的藥液，減壓回收定容至250 mL，即得黃連解毒湯提取液（1.2 g/mL）。取上述提取溶液適量，使用20%甲醇稀釋獲得按生藥量計算為50 mg/mL的稀釋溶液，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過后即得黃連解毒湯供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品約1.0 mg，加入甲醇配制成1.0 mg/mL的單一對照品儲備液。從上述各單一對照品中精密稱取儲備液適量，加入20%甲醇水稀釋，配制質量濃度為1 μg/mL的單一對照品溶液，同時從上述各單一對照品中精密量取儲備液適量，混合后加入20%甲醇水稀釋，配制得到各對照品質量濃度為1 μg/mL的對照品混合溶液。

2.2 色譜和質譜條件

2.2.1 色譜條件 使用Dionex Ultimate 3000高壓液相系統，Acquity UPLC BEH CI8色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～4 min，4%甲醇；4～10 min，4%～12%甲醇；10～30 min，12%～70%甲醇；30～35 min，70%甲醇；35～38 min，70%～95%甲醇；38～42 min，95%甲醇；42～45 min，4%甲醇。體積流量0.3 mL/min；柱溫40℃，進樣量5 μL。

2.2.2 質譜條件 使用Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀作為分析檢測的儀器；離子源為電噴霧離子源（H-ESI），輔助氣流量13 arb，輔助加熱器溫度300 ℃，離子傳輸管溫度320 ℃，自動增益控制（AGC）1×106，S-lens射頻水平50；正離子模式：鞘氣（N2）流量35 arb，噴霧電壓3.5 kV；負離子模式：鞘氣（N2）流量35 arb，噴霧電壓2.5 kV，掃描方式采用正負離子Full MS/dd-MS2模式，其中包括1次一級全掃描（分辨率為70 000 FWHM）和1次數據依賴的二級掃描（分辨率為17 500 FWHM）2個事件，正、負離子掃描范圍均為/80～1200，碰撞能梯度為20、50、100 V。

2.3 黃連解毒湯所含化合物分析

按照“2.2”項下色譜、質譜條件分別對對照品混合溶液和黃連解毒湯供試品溶液進行數據采集、結果分析。根據高分辨質譜提供的準分子離子、[M]+、[M＋H]+、[M＋Na]+、[M－H]?、[M＋COOH]?等信息提取到對應的一級質譜離子峰和精確的相對分子質量，經Xcalibur 3.0軟件在允許誤差范圍內±1×10?5擬合計算可能的元素組成，并結合對照品、報道文獻、MassBank和ChemicalBook等數據庫提供的相對保留時間及二級質譜離子碎片信息比對，進一步鑒定出黃連解毒湯所含化學成分。

2.4 組織樣品收集

給藥前將大鼠禁食12 h，自由飲水。大鼠隨機分為空白組和黃連解毒湯組，空白組給予超純水，黃連解毒湯組按照生藥量3.09 g/kg ig黃連解毒湯提取液（按65 kg成人等效劑量換算獲得），在給藥后1 h，0.3%戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈取血至未抗凝的離心管中，置于4℃箱過夜，在4500×下離心15 min（4℃）獲得血清，收集心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸，用0.9%生理鹽水清洗表面殘留血，濾紙吸干，置?80℃保存待用。

2.5 組織樣品處理

準確稱取各組織約200 mg至1.5 mL EP管中，加入1 mL色譜甲醇，使用全自動組織勻漿機（65 Hz）勻漿2 min，4500×離心15 min（4℃），取上清液800 μL至1.5 mL EP管中，溫和37℃氮氣流吹干，加80 μL 20%甲醇水溶液復溶，12 000×離心10 min，取上清液進樣。血清樣品取200 μL，加入1000 μL甲醇沉淀蛋白，12 000×離心10 min（4℃），取上清液960 μL至1.5 mL EP管，溫和37℃氮氣流吹干，加80 μL 20%甲醇水溶液復溶，12 000×離心10 min，取上清液進樣分析。

3 結果

3.1 基于UHPLC-Q-Orbitrap HR-MS技術的黃連解毒湯化學成分鑒定

基于“2.2”項下色譜、質譜條件優化后對黃連解毒湯及大鼠血清及其心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸進行數據采集、定性定量分析。在正、負離子同時掃描模式下從黃連解毒湯中共鑒定出110種化學成分，包括36種黃酮類、28種環烯醚萜、15種生物堿、15種有機酸、5種木脂素以及11種其他類化合物。其中26種化學成分經對照品比對確證，黃連解毒湯提取液總離子流圖見圖1，結果見表1。

圖1 黃連解毒湯提取液總離子流圖

表1 黃連解毒湯化學成分鑒定

續表1

峰號tR/min模式m/z誤差(×10?6)分子式化合物碎片離子 (m/z)來源類別 實測值理論值 136.74N353.086 7353.088 24.479C16H18O9新綠原酸*353.089 8, 295.871 3, 191.054 9, 179.033 7, 135.043 3M.H.有機酸 146.98N373.112 9373.114 54.146C16H22O10梔子酸[15]193.049 7, 167.070 4, 149.059 4ZZ環烯醚萜 157.19N391.123 5391.125 24.250C16H24O11山梔子苷[15]391.124 8, 350.737 5, 295.640 2ZZ環烯醚萜 167.40P427.121 1427.120 9?0.474C17H24O11去乙酰基車葉草苷酸甲酯[15]427.120 8, 265.068 5, 203.057 3, 147.043 4, 93.031 8ZZ環烯醚萜 178.15P272.128 1272.127 7?1.470C16H17NO3去甲烏藥堿[16]272.091 3, 257.753 2, 121.064 9HL/HB生物堿 188.37P (II)427.121 1427.120 9?0.334C17H24O11羥異梔子苷*427.120 3, 409.111 8, 265.067 6ZZ環烯醚萜 198.48N345.154 4345.155 73.783C16H26O8苦藏紅花酸[15]278.110 9, 183.065 1, 165.090 9ZZ環烯醚萜 208.49P347.170 0347.169 9?0.444C16H26O8茉莉苷G[15]347.170 0ZZ環烯醚萜 218.93N375.128 6375.130 34.470C16H24O10玉葉金花苷酸[15]375.069 8, 179.033 7, 167.070 0ZZ環烯醚萜 229.44N303.049 9303.051 24.128C15H12O7(2R,3R)-3,5,7,2′,6′-五羥基黃烷酮303.051 1, 217.053 7, 177.020 2, 149.024 5, 125.025 0HQ黃酮 239.49P (II)427.121 1427.120 9?0.685C17H24O11雞矢藤次苷甲酯[15]427.120 6, 285.229 9, 265.067 5, 203.053 2, 166.556 8ZZ環烯醚萜 249.67P303.049 9303.049 5?1.317C15H10O7草質素或3,5,7,2, 6-五羥基黃烷酮303.048 3, 257.046 6, 229.049 2, 153.018 7, 149.024 1HQ黃酮 259.74N179.033 9179.034 21.647C9H8O4咖啡酸*179.033 7, 135.043 6, 113.113 9, 103.918 6, 92.918 4HB/HQ/ZZ有機酸 269.78N353.086 7353.088 24.309C16H18O9綠原酸*353.087 1, 218.868 5, 191.055 0, 179.033 8, 135.043 6M.H.有機酸 2710.08P347.170 0347.169 9?0.703C16H26O8茉莉苷B[15]347.170 0ZZ環烯醚萜 2810.27N367.102 4367.103 22.401C17H20O9阿魏酰奎寧酸異構體[16]193.049 7, 173.044 0, 134.035 8HB/HL/ZZ有機酸 2910.76N353.086 7353.088 24.309C16H18O9隱綠原酸*353.088 1, 309.613 4, 191.054 9M.H.有機酸 3011.65P342.170 0342.169 7?0.978C20H23NO4黃柏堿*342.169 7, 326.102 0, 299.138 5HB生物堿 3112.27N549.181 4549.182 82.555C23H34O15京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷*549.181 3ZZ環烯醚萜 3212.54P328.154 3328.153 9?1.233C19H21NO4波爾定堿[16]328.153 3, 283.095 6, 265.085 4HL生物堿 3312.60P303.049 9303.049 5?1.317C15H10O7五羥基黃酮303.048 3, 257.046 6, 229.049 2HQ黃酮 3412.94N163.039 0163.039 10.548C9H8O3對香豆酸[15]163.038 8, 149.059 3, 137.095 7M.H.有機酸 3513.47N387.128 6387.129 42.110C17H24O10梔子苷*387.128 5, 225.075 3, 175.038 9, 147.043 4, 123.043 5ZZ環烯醚萜 3613.48P227.091 4227.091 0?1.762C11H14O5京尼平*227.081 3, 209.080 7, 163.075 2ZZ環烯醚萜 3713.48P121.064 8121.065 01.557C8H8O苯乙酮[15]121.064 9, 119.090 3, 95.049 5ZZ其他 3813.82N367.102 4367.103 22.319C17H20O9阿魏酰奎寧酸異構體[16]193.049 7, 173.044 0, 134.035 8HB/HL/ZZ有機酸 3914.21N367.102 4367.103 22.319C17H20O9阿魏酰奎寧酸異構體[16]193.049 7, 173.044 0, 134.035 8HB/HL/ZZ有機酸 4015.10P331.175 1331.174 9?0.784C16H26O7茉莉苷A[15]331.129 9, 267.100 9, 191.070 6ZZ環烯醚萜 4115.22P192.065 5192.065 4?0.779C10H9NO3降氧化北美黃蓮次堿[14]192.064 8, 177.956 0, 163.976 7, 128.950 6, 113.963 9HB/HL生物堿 4215.50P331.175 1331.174 9?0.995C16H26O7茉莉苷E[15]331.129 9, 267.100 9, 191.070 6ZZ環烯醚萜 4315.61N681.238 9681.240 62.479C32H42O16松脂醇二葡萄糖苷[17]340.155 2, 325.131 8, 135.420 1HL木脂素 4415.67N183.101 6183.101 81.142C10H16O3茉莉醇[15]183.101 3, 157.121 7, 139.111 2ZZ環烯醚萜

續表1

峰號tR/min模式m/z誤差(×10?6)分子式化合物碎片離子 (m/z)來源類別 實測值理論值 4516.00N385.112 9385.113 82.277C17H22O10芥子酰基葡萄糖苷[15]325.093 0, 265.071 5, 223.060 5HB其他 4616.35P322.107 4322.106 9?1.504C19H16NO4小檗紅堿*322.106 1, 307.082 9, 276.872 8HL生物堿 4717.04P324.123 0324.122 5?1.649C19H18NO4＋去亞甲基小檗堿*324.122 4, 309.099 6, 291.101 9, 263.105 5, 191.082 5HB/HL生物堿 4817.39P320.091 7320.090 9?2.576C19H13NO4黃連堿*320.091 2, 307.082 8, 292.096 6, 264.099 5HL生物堿 4917.90N547.144 6547.146 12.637C26H28O13白楊素-6-C-五糖- 8-C-己糖苷547.146 4, 457.122 4, 427.101 5, 367.086 2, 337.072 5HQ黃酮 5018.10P (III)336.123 0336.122 4?1.858C20H17NO4小檗堿*336.122 7, 321.099 1, 292.096 3HB/HL生物堿 5118.20N547.144 6547.145 92.418C26H28O13白楊素-6-C-α-L-阿拉伯糖苷-8-C-β- D-葡萄糖苷547.148 2, 457.115 0, 427.098 1, 367.082 3, 337.072 3HQ黃酮 5218.32N581.222 9581.224 62.998C26H28O13(?)-南燭木樹脂酚- 3α-O-β-D-葡萄糖苷[15]371.114 6, 223.060 5, 195.065 4, 165.054 5HB/HL木脂素 5318.70N547.144 6547.145 92.290C26H28O13白楊素-6-C-五糖- 8-C-己糖苷547.143 2HQ黃酮 5418.80P338.138 7338.138 2?1.492C20H19NO4藥根堿[16]338.137 8, 323.078 2, 248.878 0HB/HL生物堿 5518.85N519.186 1519.187 01.776C26H32O11松脂醇葡萄糖苷[17]345.155 2, 329.140 1, 173.044 2, 155.033 7HL木脂素 5618.91N609.145 0609.146 72.723C27H30O16蘆丁*609.145 8, 365.695 7, 300.027 1, 243.784 9, 151.002 0ZZ黃酮 5719.10N623.197 0623.198 42.107C29H36O15毛蕊花糖苷*623.201 7, 461.165 8, 179.035 3HQ黃酮 5819.10N345.060 5345.061 73.612C17H14O8粘毛黃芩素III345.062 4, 330.039 2, 315.016 0HQ黃酮 5919.20N547.144 6547.146 02.527C26H28O13白楊素-6-C-β-D-葡萄糖苷-8-C-β-L-阿拉伯糖苷547.146 5, 457.115 7, 427.104 6, 367.082 2, 337.071 4HQ黃酮 6019.40N461.071 5461.072 82.880C21H18O12野黃芩苷*461.072 6, 285.040 5HQ黃酮 6119.52P334.107 4334.106 9?1.360C20H15NO4甲基黃連堿*334.106 7HL生物堿 6219.80N547.144 6547.146 12.637C26H28O13白楊素-6-C-己糖- 8-C-五糖苷547.150 1, 457.114 7, 427.104 2, 367.082 6, 337.071 5HQ黃酮 6319.97P431.227 6431.227 5?0.183C21H34O9(1R,7R,8S,10R)-7,8, 11-三羥基愈創木- 4-烯-3-酮-8-β-D-吡喃葡萄糖苷[15]269.173 9, 251.163 6, 233.153 3, 163.111 5, 137.095 8ZZ環烯醚萜 6420.00N579.170 8579.172 62.966C27H32O146′-O-反式-芥子酰基梔子新苷[15]367.102 6, 325.092 2, 265.071 3, 223.060 4, 193.049 5ZZ環烯醚萜 6520.20N581.186 5581.188 53.541C27H34O142,4,6-三羥基二氫查耳酮-3-C-β-D-葡萄糖苷-6-O-β-D-葡萄糖苷581.188 0, 461.146 8, 329.105 6, 299.092 8, 167.035 8HQ黃酮 6620.33P352.154 3352.153 9?1.234C21H22NO4巴馬汀*352.153 8, 337.130 0, 308.127 5, 254.886 6HB/HL生物堿 6720.59N593.150 1593.151 11.726C27H30O15山柰酚-3-O-葡萄糖苷-3′′-鼠李糖苷[15]593.148 4, 325.092 4, 284.032 4, 207.029 1, 163.038 7ZZ黃酮

續表1

續表1

*通過對照品確認 N-負離子模式[M－H]?N (II)-負離子模式[M＋HCOO]?P-正離子模式[M＋H]+P (II)-正離子模式[M＋Na]+P (III)-正離子模式[M]+HB-黃柏 HL-黃連 HQ-黃芩 ZZ-梔子 M.H.-全部藥材

*confirmed by comparison with the reference substances N-[M－H]?N (II)-[M＋HCOO]?P-[M＋H]+P (II)-[M＋Na]+P (III)-[M]+HB-Schneid. HL-Franch. HQ-Georgi ZZ-Ellis M.H.-a variety of medicinal materials

3.1.1 有機酸類 從黃連解毒湯中鑒定的有機酸成分共15種，主要來源于4味藥材，包括奎寧酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、3(3-羥基-3-甲基)戊二酰基奎寧酸、4--(3-羥基-3-甲基)戊二酰基奎寧酸、5--(3-羥基-3-甲基)戊二酰基奎寧酸、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、對香豆酸、4芥子酰基-5咖啡酰基奎寧酸以及阿魏酰奎寧酸異構體。

以奎寧酸和綠原酸（3-咖啡酰奎寧酸）二級質譜[M－H]?離子模式下裂解碎片推導過程為例，奎寧酸和綠原酸都在負離子模式下有較好的響應，一級質譜得到奎寧酸/191.018 5 [M－H]?準分子離子峰，經Xcalibur元素組成擬合化學式為 C7H11O6，在高能H-ESI質譜離子源碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子信息為/173.008 1 [M－H－H2O]?和/146.937 0 [M－H－COOH]?2個離子碎片，/173.008 1 [M－H－H2O]?碎片進一步裂解得到/129.017 6 [M－H－H2O－CO2]?的離子碎片，/146.937 0 [M－H－COOH]?與/129.017 6 [M－H－H2O－CO2]?2個碎片分別失去-H3O2和H2O得到/111.007 1離子碎片。綠原酸一級質譜得到/353.088 1 [M－H]?準分子離子峰，經Xcalibur元素組成擬合化學式為C16H17O9，在高能H-ESI質譜離子源碰撞離子作用下獲得/191.054 9 [M－H－C9H6O3]?和/179.033 7 [M－H－C7H10O5]?離子碎片，/179.033 7離子碎片進一步裂解為/135.043 5 [M－H－CO2]?。從裂解獲得的一級、二級質譜離子碎片/值分析，奎寧酸和綠原酸化合物裂解途徑符合有機酸的裂解規律，與文獻報道裂解途徑相似[19-20]，同時通過對照品的一級、二級質譜裂解碎片和提取離子峰位置、相對保留時間比對，最終確定化合物分別為奎寧酸（C7H11O6）與綠原酸（C16H17O9），相應質譜裂解途徑見圖2。

3.1.2 生物堿類 從黃連解毒湯中鑒定出15種生物堿成分，主要來源于黃芩、黃連、黃柏3味藥材，包括小檗堿、黃連堿、黃柏堿、白栝樓堿、4-甲氧基--甲基-2-羥基喹啉、去甲烏藥堿、波爾定堿、降氧化北美黃蓮次堿、小檗紅堿、去亞甲基小檗堿、藥根堿、甲基黃連堿、巴馬汀、鐵屎米酮、γ-崖椒堿。以小檗堿和黃連堿二級質譜[M]+離子模式下裂解碎片推導過程為例，小檗堿和黃連堿都在正離子模式下響應較好，一級質譜得到小檗堿[M]+準分子離子峰，經Xcalibur元素組成擬合化學式為C20H18NO4，在高能H-ESI質譜離子源碰撞離子作用下獲得二級碎片離子/336.122 5 [M]+，依次裂解為/321.099 0 [M－CH3]+、/292.097 1 [M－CH3－CHO]+離子碎片；同樣黃連堿一級質譜得到/320.091 2 [M]+準分子離子峰，經Xcalibur元素組成擬合化學式為C19H14NO4，在高能H-ESI質譜離子源碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子信息為/292.096 6 [M－CO]+、/292.096 6 [M－CO]+可能進一步裂解為/264.099 5 [M－CO]+2種結構形式；由以上裂解/值可知小檗堿和黃連堿化合物裂解途徑符合生物堿的裂解規律，與文獻報道裂解途徑相似[21]，通過對照品的一級、二級質譜裂解碎片和提取離子峰位置、相對保留時間比對，最終確定化合物分別為小檗堿（C20H18NO4）與黃連堿（C19H14NO4），相應質譜裂解途徑見圖3。

圖2 奎寧酸與綠原酸的質譜棒狀圖(A、B) 和裂解途徑(C、D)

3.1.3 黃酮類 黃酮類化合物是植物中普遍存在的一類化合物，多與糖苷結合而成。此類化合物在裂解時，多先斷裂糖苷或易掉羧基。本實驗從黃連解毒湯中共鑒定出36種黃酮類成分，主要來源于黃芩藥材，包括黃芩苷、漢黃芩苷、去甲漢黃芩素、黃芩素、蘆丁、毛蕊花糖苷、粘毛黃芩素III、野黃芩苷、(2,3)-3,5,7,2′,6′-五羥基黃烷酮、熊竹素、草質素或3,5,7,2,6-五羥基黃烷酮、五羥基黃酮、白楊素-6-五糖-8-己糖苷、白楊素-6-α--阿拉伯糖苷-8-β葡萄糖苷、白楊素-6-β葡萄糖苷- 8-β--阿拉伯糖苷、白楊素-6-己糖-8-五糖苷、2,4,6-三羥基二氫查耳酮-3-β葡萄糖苷- 6β葡萄糖苷、山柰酚-3葡萄糖苷-3′′-鼠李糖苷、白楊素-6-β葡萄糖苷、漢黃芩素-7谷氨酸、5,7,2′-三羥基-6-甲氧基黃酮-7葡萄糖醛酸苷、粘毛黃芩素II-2′β葡萄糖苷、粘毛黃芩素II-2′β葡萄糖苷異構體、漢黃芩素-5β葡萄糖苷、蒙花苷、去甲漢黃芩素-7β葡糖苷酸、(2)-5,7-二羥基-6-甲氧基黃烷酮-7β葡萄糖醛酸苷、白楊素-7β葡萄糖醛酸苷、5,7,8-三羥基-6-甲氧基黃酮-7葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-8β葡糖苷酸、木蝴蝶素-A-7葡萄糖苷、5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮-7葡萄糖醛酸吡喃糖苷、山姜素、5,7-二羥基-8,2′-二甲氧基黃酮- 7β葡萄糖醛酸苷、熊竹素。

圖3 小檗堿與黃連堿的質譜棒狀圖(A、B) 和裂解途徑(C、D)

以黃芩苷二級質譜[M－H]?離子模式下裂解碎片推導過程為例，黃芩苷在負離子模式下有較好的響應，一級質譜獲得黃芩苷[M－H]?準分子離子峰，經Xcalibur元素組成擬合化學式為C21H17O11，在高能H-ESI質譜離子源碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子有/283.061 5 [M－H－C5H6O6]?、/269.045 2 [M－H－C6H8O6]?離子碎片；黃芩苷化合物裂解途徑符合黃酮類化合物的裂解規律，與文獻報道裂解途徑相似[22]，通過對照品的一級、二級質譜裂解碎片和提取離子峰位置、相對保留時間比對，最終確定化合物為黃芩苷（C21H17O11）、相應質譜裂解途徑見圖4。

3.1.4 環烯醚萜類 從黃連解毒湯中鑒定出環烯醚萜類成分共28種，主要來源于梔子藥材，包括梓醇、梔子苷、梔子酸、梔子新苷、山梔子苷、去乙酰基車葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、苦藏紅花酸、茉莉苷（A、B、E、G、T）、玉葉金花苷酸、雞矢藤次苷甲酯、京尼平-1-β龍膽雙糖苷、京尼平、茉莉醇、(1,7,8,10)-7,8,11-三羥基愈創木-4-烯-3-酮- 8-β吡喃葡萄糖苷、6′反式-芥子酰基梔子新苷、6反式-對香豆酰基京尼平龍膽雙糖苷、6反式-芥子酰基京尼平龍膽雙糖苷、6反式-阿魏酰基京尼平龍膽雙糖苷、芥子苷L、6′- sinapoyljasminoside A、6反式芥子苷C、erubigenin。

圖4 黃芩苷與梔子苷的質譜棒狀圖(A、B) 和裂解途徑(C、D)

以梔子苷的二級質譜[M－H]?離子模式下裂解碎片推導過程為例，梔子苷在一級質譜中獲得準分子離子為/387.128 5 [M－H]?，經Xcalibur元素組成擬合化學式為C17H23O10，在高能H-ESI質譜離子源碰撞離子作用下首先獲得二級碎片離子/225.075 3 [M－C6H10O5]?，該離子碎片進一步裂解為/207.065 1 [M－H－C6H10O5－H2O]?和/123.043 5 [M－H－C6H10O5－C4H6O3]?；同時/207.065 1繼續裂解獲得/123.043 5 [M－H－C6H10O5－H2O－C4H4O2]?和/101.022 7 [M－H－C6H10O5－H2O－C7H6O]?離子碎片；從裂解碎片/值推導可知，梔子苷化合物裂解途徑符合環烯醚萜類的裂解規律，與文獻報道裂解途徑相似[22]，同時通過對照品的一級、二級質譜裂解碎片和提取離子峰位置、相對保留時間比對，最終確定化合物為梔子苷（C17H23O10），相應質譜裂解途徑見圖4。

3.1.5 木脂素與其他類 從黃連解毒湯中鑒定出5種木脂素類成分與11種其他類成分，包括：松脂醇二葡萄糖苷、(?)-南燭木樹脂酚-3-αβ葡萄糖苷、松脂醇葡萄糖苷、白花敗醬醇苷或同分異構體、苯乙酮、黃柏內酯、黃柏酮、黃柏呈、13-順式-西紅花苷I、西紅花苷（I、II、III）、西紅花酸、芥子酰基葡萄糖苷以及全反式西紅花酸二-β葡萄糖酯。

3.2 大鼠血清及各組織轉移化學成分鑒定

基于“3.1”項下的鑒定結果，將提取物中鑒定的化學成分在黃連解毒湯組與空白組的生物樣品中進行比較提取分析，結合保留時間及碎片離子信息，發現給予大鼠ig黃連解毒湯后，血清中檢測到梔子新苷、梔子苷、茉莉苷（A、B、E）、3種阿魏酰奎寧酸異構體、黃柏堿、京尼平-1-β--龍膽雙糖苷、對香豆酸、京尼平、苯乙酮、降氧化北美黃蓮次堿、茉莉醇、小檗紅堿、去亞甲基小檗堿、黃連堿、3種白楊素-6--五糖-8--己糖苷、白楊素-6--α--阿拉伯糖苷-8--β--葡萄糖苷、小檗堿、藥根堿、白楊素-6--β--葡萄糖苷-8--β--阿拉伯糖苷、6′--反式-芥子酰基梔子新苷、巴馬汀、白楊素- 6--β--葡萄糖苷、漢黃芩素-7--谷氨酸、去甲漢黃芩素、黃芩苷、(2)-5,7-二羥基-6-甲氧基黃烷酮- 7--β--葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶素-A-7--葡萄糖苷、漢黃芩苷、5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮-7--葡萄糖醛酸吡喃糖苷、5,7-二羥基-8,2′-二甲氧基黃酮- 7β葡萄糖醛酸苷、千層紙素A、熊竹素、西紅花酸、erubigenin共40種成分，分別從心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸中鑒定出50、55、65、61、62、32、46種原型成分。血清、腦、肺、心、肝、腎組織中原型成分的提取離子峰圖見圖5～7，各組織成分的基本信息見表1。根據各原型成分在原方、血清及各組織中的均一化的峰面積，繪制了相應的熱圖（圖8），由圖可知梔子新苷、黃連堿、小檗堿、巴馬汀、藥根堿、黃柏堿等成分在肝、腎等組織中有較大的暴露量。

圖5 大鼠口服黃連解毒湯后血清(A)和腦(B) 總離子流圖與提取離子峰圖

4 討論

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS聯用技術，具有分離能力強、靈敏度高、穩定性好以及定性定量準確等優勢特點，目前被廣泛應用于中藥或復雜基質中待測成分的篩選、鑒定及定量分析[13,20,23]。本實驗借助于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HR-MS技術，選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇體系，梯度洗脫條件下系統、準確、快速地實現黃連解毒湯化學成分鑒定，通過比較黃連解毒湯中化合物在正、負離子模式下的總離子流圖，發現所鑒定的化合物在2種模式下分離效果好、響應好。其中黃酮類、有機酸類以及糖類多在負離子模式下響應較好；生物堿、環烯醚萜類多在正離子模式下響應較好。在該條件下能較為全面的表征黃連解毒湯的化學組成，相較于孫健等[10]與黃濤陽等[24]利用液質聯用技術僅鑒定出11種與15種化學成分，本研究共鑒定了110種化學成分，其中26種通過對照品比對確認，很大程度上增加了對黃連解毒湯所含化學成分的認識；并在此基礎上近一步明晰了大鼠ig黃連解毒湯后主要成分的組織分布特征，發現大鼠口服黃連解毒湯提取物后在血清、心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸中檢測到40、50、55、65、61、62、32、46種原型成分，其中肺、脾和肝檢測到的成分種類較多。眾所周知，中藥復方極其復雜多樣的化學成分與對疾病的綜合調節作用，既是中醫藥的特色優勢，也是明晰其效應基礎的難點，明確復方主要化學成分、入血及組織分布特征，對于解析其藥效物質具有較大的參考意義。例如本研究中發現黃連解毒湯口服后，有32種化學成分在腦組織中被檢測到，其中小檗堿、黃連堿、黃柏堿等生物堿成分有較好的分布，提示在研究黃連解毒湯針對阿爾茨海默病、腦缺血等腦部疾病時可更多關注這些入腦的化學成分。此外，值得關注的是中藥化學成分在體內可能會在腸道或肝臟中發生代謝轉化，產生相應代謝產物，一些代謝產物被報道具有很好的藥理活性，如小檗堿在腸道的變形桿菌屬BM1和BM2作用下能夠轉化為小檗紅堿、藥根堿、非洲防己堿、唐松草酚定和2,3-去亞甲基小檗堿，其中小檗紅堿與小檗堿在調血脂和降血糖具有相似的生物活性[25]；黃芩苷在腸道中轉化為黃芩素，吸收到體內后又可以代謝轉化為黃芩苷，或者通過甲基化與葡萄糖醛酸化轉化生成千層紙素-A-7葡萄醛酸，相關葡萄醛酸化物在抗凝血方面均表現出顯著活性[26]。本研究僅對黃連解毒湯原型成分入血與組織分布進行了分析鑒定，缺少代謝產物的分析，后續有必要關注黃連解毒湯主要化學成分的體內藥物代謝情況，明確黃連解毒湯體內代謝產物。中藥復方具有成分復雜、作用機制復雜、提取復雜、多適應癥以及多效應等特點，其對機體和疾病的調控作用通常是多通道、多靶點、全方位的整體協調效應，有利有弊。黃連解毒湯清熱解毒劑，方中以黃連為君藥能夠瀉心火，作用在中焦；黃芩為臣藥能夠清上焦火，黃柏和梔子共為佐藥，清瀉下焦之火，梔子通過導熱下行而清瀉三焦。四藥齊用去除三焦之火邪而清熱解毒，達到消除病癥。近年來隨著黃連解毒湯藥理研究的深入，越來越多的藥理被證實，新的適應癥也在不斷的發現。陸允等[27]和張建等[28]通過大鼠服用黃連解毒湯有效部位（總生物堿、總黃酮、總環烯醚萜）后對其腦缺血大鼠白質損傷研究表明，有效部位對大鼠軸突修復抑制信號勿動蛋白NogoA和勿動蛋白受體Nogo receptor有調控作用。能夠抑制星形膠質細胞過度活化，干預Cx43表達，保護缺血半暗帶神經細胞。崔曉娟等[29]初步證實小鼠服用黃連解毒湯后減輕DSS誘導的UC小鼠結腸黏膜炎癥浸潤和黏膜損傷，是黃柏內酯、巴馬汀和小檗堿作用于MMP9，CASP3靶點進而調節多種經典炎癥通路以控制結腸組織炎癥。Liu等[30]采用網絡藥理學方法（化學-靶點-通路）研究梔子中環烯醚萜類的藥理作用機制，篩選出梔子苷在內的6種環烯醚萜結合BCL2等36個靶標通路作用于中焦消除炎癥。Qi等[31]研究證實黃連解毒湯中主要成分小檗堿、黃連堿等能夠損壞細菌細胞壁，能使細胞表面凹陷，出現空洞，從而抑制致病菌。除此以為黃芩苷、黃連堿、黃柏堿的部分藥理作用機制被證實，以上研究涉及黃連解毒湯中的化學成分十分有限，而復方中大量其他化學成分的在其藥效發揮中的作用仍不夠清晰，本研究系統開展了黃連解毒湯化學成分與組織分布研究，對于解析其藥效活性物質具有促進作用，后續研究中可以更關注藥效靶器官中暴露的化學成分。然而，即使本研究中已有26種化學成分是通過對照品比對確認，仍存在部分化學成分存在同分異構體，未能充分的識別，后續可結合多種不同分析技術或化學分離等手段予以明晰。有研究表明小檗堿可以抑制黃芩苷的吸收，而黃芩苷可以促進小檗堿的吸收[32]，同時有研究報道了小檗堿在肝臟中主要被CYP2D6和CYP1A2代謝，分別生成去亞甲基小檗堿、唐松草酚定或小檗紅堿，小檗堿對CYP2E1和CYP2D6具有抑制作用，對CYP3A4和CYP1A2有誘導作用[33]，這些研究提示黃連解毒湯包含的化學成分之間可能存在有復雜的相互作用，這些相互作用最后體現為協同增效還是配伍減毒不得而知，后續十分也有必要開展相關研究，以增加對中藥復方配伍的認識。此外，本研究中的組織分布僅為定性分析，且關注僅原型成分，對代謝產物未做鑒定，后續仍需要開展更為全面的體內代謝過程研究，并結合體內外藥效評價模型，開展更為深入的藥效物質基礎及作用機制研究，以期最終闡明黃連解毒湯的藥效物質基礎，為該方的臨床科學合理應用及相關的新藥研發提供科學依據。

圖6 大鼠口服黃連解毒湯后肺(A)和心(B) 總離子流圖與提取離子峰圖

圖7 大鼠口服黃連解毒湯后肝(A)和腎(B) 總離子流圖與提取離子峰圖

圖8 黃連解毒湯原方成分與大鼠口服后血清及組織中轉移成分峰面積的熱圖(均一化峰面積×10?6)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical profiling and tissue distribution study of Huanglian Jiedu Decoction in rats by UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS

WANG Yong-li1, HUANG Guang-jian3, LIU Cong-jin3, QI Sheng-lan1, LI Rong-sheng2, LIU Wei1, 2

1. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;2. Institute of Liver Diseases, Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases, Ministry of Education, Shanghai Key Clinical Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 3. Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

The UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS technology was used to efficiently, quickly and accurately analyze and identify the chemical components of Huanglian Jiedu Decoction (HJD, 黃連解毒湯) and the distribution of its main components in different tissues after oral administration in rats.An Acquity UPLC BEH C18column (100 mm ×2.1 mm, 1.7 μm) was used for chromatographic separation, with 0.1% formic acid aqueous solution-methanol as mobile phase gradient elution. Chemical constituents in HJD were rapidly isolated and identified by HRMS in the positive and negative ion mode with both full scan and two stage threshold-triggered mass modes (Full MS/dd-MS2). On this basis, the transitional components in the blood and tissues of rats after oral administration of HJD were identified.A total of 110 chemical constituents were identified from Huanglian Decoction Soup, including 36 kinds of flavonoids, 28 kinds of iridoids, 15 kinds of alkaloids, 15 kinds of organic acids, 5 kinds of lignans, and 11 kinds of other compounds, by the primary and secondary mass spectrometry information of the compounds, combined with the confirmation of the retention times and MS/MS spectra of the standards by comparison and analysis of related literature. After oral administered HJD to rats, 40, 50, 55, 65, 61, 62, 32, 46 prototype compounds were detected in serum, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, and testicles, respectively. According to the homogenization peak area of each prototype component in the extract, serum and tissues, it can be known that gardoside, coptisine, berberine, palmatine, jatrorrhizine, phellodendrine have large exposure in liver, kidney, and other tissues.With the help of ,UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS method, the identification of the constituents in HJD was systematically, accurately and rapidly achieved, and the tissue distribution of main components were investigated in rats following oral administration of HJD. These findings provided key information and guidance for further studies on pharmacodynamic substances and clinical applications of HJD.

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS; Huanglian Jiedu decoction; tissue distribution; pharmacodynamic substance;geniposide;coptisine; berberine; palmatine;jateorhizine; phellodendrine

R284.1

A

0253 - 2670(2022)22 - 6985 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.002

2022-03-24

國家自然科學基金項目（81703681）；中國科協青年托舉工程項目（2020QNRC001）；上海市教育委員會和上海市教育發展基金會“晨光計劃”項目（20CG50）；上海市科技創新行動計劃項目（20S21902600）；上海市科技創新行動計劃項目（19401972700）

王永麗，碩士，實驗師，從事中藥藥效物質基礎及質量標準研究。E-mail: ylwang521@126.com

劉 偉，博士，副研究員，從事中藥復方藥效物質基礎與體內過程研究。Tel: (021)20256526 E-mail: lwhzayl@163.com

李榮勝，工程師，從事藥物分析及藥物代謝動力學研究。Tel: (021)20256526 E-mail: rongsheng.li@shhhzy.com

[責任編輯 王文倩]