代謝組學(xué)在動物育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景展望

李文通 ， 嚴(yán)善英 ， 吳添文

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東 深圳 518120）

代謝組學(xué)（metabonomics）是以分子量1 000以下的小分子代謝物為研究對象，采用高效液相色 譜（high performance liquid chromatography,HPLC）、質(zhì)譜（mass spectrum, MS）、色譜質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）等技術(shù)，與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法相結(jié)合，通過分析圖譜數(shù)據(jù)識別并定量生物體內(nèi)源性和外源性代謝物的成分以及其代謝途徑的變化過程，從而反映復(fù)雜生命體整體功能及狀態(tài)的新技術(shù)[1-2]，在疾病研究[3]、藥物開發(fā)[4]、毒性評價(jià)[5]、環(huán)境科學(xué)[6]等領(lǐng)域已經(jīng)得到較為廣泛的應(yīng)用。代謝組學(xué)研究可以在生物體的生命活動過程中快速、有效地捕捉到細(xì)微差異[7]，填充了基因與表型之間的空缺，是后基因組學(xué)的重要組成之一。代謝組學(xué)在農(nóng)用動物中的研究起步較晚，但其具有無創(chuàng)傷性、快速、靈敏、成本低等明顯優(yōu)勢，已成為農(nóng)用動物育種研究的重要工具。本文從遺傳參數(shù)估計(jì)、品種（系）鑒定、重要經(jīng)濟(jì)性狀鑒定、多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析、動物疾病模型中的應(yīng)用5個方面介紹了代謝組學(xué)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景，分析代謝組學(xué)研究中存在的問題，為后續(xù)的代謝組學(xué)在農(nóng)用動物育種中的應(yīng)用提供一些思路。

1 代謝組學(xué)的發(fā)展概況

早在 20 世紀(jì) 70年代初，Devaux 等[8]首次提出代謝輪廓分析，運(yùn)用氣相色譜技術(shù)（gas chromatography,GC）對患者的體液代謝物進(jìn)行了定性、定量分析，進(jìn)而完成疾病的臨床診斷，這種通過代謝譜來分析、診斷疾病的方法至今仍在沿用。1983年，荷蘭科學(xué)家 Van der Greef 等[9]首先使用核磁共振技術(shù)、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合的方法分析了大鼠尿液中的代謝指紋。同年，Nicholson 等[10]檢測并發(fā)表了首個關(guān)于全血和血漿的核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR）。直到 1997年，Oliver[11]正式提出了metabolome 的概念。1999年，Nicholson等[2]對代謝組學(xué)進(jìn)行了定義，即在內(nèi)因（病理、生理或基因修飾等）和外因的刺激下，定量測定生物體產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，這是個動態(tài)的過程，并將代謝組學(xué)稱為 metabonomics。2003年，F(xiàn)iehn 等[12]提出metabolomics 的概念，他們認(rèn)為代謝組學(xué)是個靜態(tài)的過程，也可以稱之為代謝物組學(xué)，是對1個或幾個特定時(shí)間和條件下的細(xì)胞、生物流體、組織或生物體等特定的生物樣本中所有小分子代謝物進(jìn)行定性、定量分析，同時(shí)把鑒定的代謝產(chǎn)物與基因功能相關(guān)聯(lián)。此外，根據(jù)不同的研究目的，F(xiàn)iehn 將代謝組學(xué)分為4個層次：①代謝物的靶標(biāo)分析，即對生物體中1個或幾個特定組分進(jìn)行定性和定量分析；②代謝輪廓（譜）分析，即對特定代謝過程中一小部分結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相關(guān)的預(yù)設(shè)代謝物，利用針對性的分析技術(shù)進(jìn)行定性和半定量分析；③代謝指紋，即整體性地對樣本多個代謝物進(jìn)行定性分析，不進(jìn)行單一成分的鑒定，代謝指紋常用于對樣本的快速分類，如表型的快速鑒定；④代謝組分析，即對小分子代謝物進(jìn)行定性和定量分析，其代謝物可以是生物體內(nèi)1個組織中的，也可以是幾個特定組織的，更為重要的是，其可以在外界干預(yù)或病理?xiàng)l件下進(jìn)行相應(yīng)的研究，例如代謝物與生理變化相對應(yīng)的動態(tài)變化規(guī)律的研究[13]。代謝組學(xué)迅速發(fā)展，已經(jīng)在藥物篩選、疾病診斷等方面取得了重大的研究進(jìn)展，并在畜禽等動物育種中有了初步的應(yīng)用，并形成了metabonomics 和metabolomics 2個主要領(lǐng)域。

2 代謝組學(xué)在動物育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀

體液是家畜代謝組學(xué)研究的主要樣本，如牛主要以血液、精液和乳汁為研究對象，豬、山羊和綿羊主要以血液、膽汁、腦脊液、尿液等為研究對象，分析鑒定得到的小分子代謝物也較多；而組織樣本研究相對較少，主要以肝臟、肌肉和脂肪為主?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，Goldansaz 等[14]在LMDB（lightning memory-mapped database）數(shù)據(jù)庫中收集1 070個小分子代謝物，其代謝物是在不同物種和不同樣本中檢測到的，數(shù)據(jù)庫除了收集每個小分子代謝物的物理和化學(xué)性質(zhì)外，還收集其他注釋信息，例如一些特定樣本中代謝小分子的標(biāo)準(zhǔn)化水平[15]。

動物育種領(lǐng)域的代謝組學(xué)研究主要集中在牛和豬的代謝物檢測上，一般通過對乳或肉品質(zhì)的代謝解析等研究來篩選出不同品種（系）的生物標(biāo)記物和獲得代謝分子遺傳參數(shù)估計(jì)值。此外，代謝分子與重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系及全基因組的關(guān)聯(lián)分析研究（genome-wide association studies with metaotypes,mGWAS）等方面也關(guān)注較多[15]。相對牛和豬而言，代謝組學(xué)技術(shù)在其他家畜物種的研究相對較少，而且多集中于非遺傳學(xué)研究上，如疾病檢測相關(guān)的生物標(biāo)記物開發(fā)、食品/藥品添加劑使用效果的檢測、營養(yǎng)生理學(xué)的研究等。

2.1 動物代謝分子遺傳參數(shù)估計(jì)

遺傳參數(shù)估計(jì)在動物育種中具有十分重要的意義，例如育種方案的制定以及選種效果的評估都離不開遺傳參數(shù)，外界環(huán)境和生活習(xí)慣都會影響生物體的代謝水平。因此，代謝組學(xué)圖譜局限性很強(qiáng)，分析得到的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)只能代表該生物樣本在某一特定時(shí)間內(nèi)的代謝狀態(tài)[15]。當(dāng)以代謝物作為中間性狀來進(jìn)行遺傳學(xué)分析時(shí)，需要對代謝物的表達(dá)水平進(jìn)行遺傳參數(shù)估計(jì)。在家畜群體中，研究人員已經(jīng)系統(tǒng)地估計(jì)了牛、豬和雞的各類代謝小分子的遺傳參數(shù)。

目前，代謝分子遺傳參數(shù)估計(jì)在牛中的研究最多。Nazari 等[16]對伊朗水牛乳脂率及與270 d乳汁產(chǎn)量相關(guān)的遺傳力進(jìn)行評估，哺乳期PM1、PM2、PM3 的遺傳力參數(shù)分別為 0.20～0.48、0.36～0.47 和 0.19～0.35。同時(shí)，Gebreyesus 等[17]從 21個群體中選擇了650 頭荷斯坦奶牛，估算了幾種關(guān)鍵乳蛋白的遺傳力，發(fā)現(xiàn)不同乳蛋白的遺傳力分布較廣，在0.05～0.78 之間不等。在針對豬的研究中，研究者們以豬肉品質(zhì)性狀為重點(diǎn)研究對象，分析了各種長鏈多不飽和脂肪酸的遺傳力，發(fā)現(xiàn)其遺傳力通常在0.50 以上[18-19]。此外，研究人員還在雞上開展了相關(guān)研究，對血液生化指標(biāo)相關(guān)的遺傳參數(shù)進(jìn)行了估計(jì)。Dong 等[20]比較了高低脂肉雞的19 種血漿生化參數(shù)水平，其中11 種血漿生化指標(biāo)（甘油三酸酯、總膽汁酸、極低密度脂蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白、總蛋白、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、尿酸、肌酐）存在顯著差異，遺傳力估計(jì)值居中，在0.21～0.43 之間。Zhang 等[21]采集了 332 只正常進(jìn)食和限制飲食條件下的廣西黃雞的血液，檢測其生化指標(biāo)和腹部脂肪的性狀，發(fā)現(xiàn)總膽固醇、甘油三酯等血液生化指標(biāo)在進(jìn)食狀態(tài)下具有較高的遺傳力（0.26～0.60）；而在禁食狀態(tài)下，這些血液生化指標(biāo)的遺傳力（0.22～0.59）有所降低。

2.2 代謝分子在品種（系）鑒定中的應(yīng)用

畜禽不同品種（系）、不同性別、不同組織或體液等生物樣本中的小分子代謝物差別較大，可以篩選出一些小分子代謝物來作為標(biāo)志物，用于區(qū)分畜禽的不同性別，甚至是不同的品種（系）。這為研究畜禽差異性狀的表征提供了一定的理論依據(jù)。目前，已經(jīng)報(bào)道各品種（系）間家養(yǎng)動物小分子代謝物表達(dá)水平具有顯著差異。Foroutan等[22]利用 LC-MS/MS、NMR 和 ICP-MS（inductively coupled plasma massspectrometry）鑒定和定量了145 種牛的血清代謝物，篩選出甲酸鹽、亮氨酸、丁酰肉堿和溶血磷脂膽堿（28: 0）等一批可用于區(qū)分不同品種（系）的代謝標(biāo)志物，且成功確定了2 類可以對飼料利用率進(jìn)行分類預(yù)測的重要候選生物標(biāo)志物。Bovo 等[23]首次應(yīng)用無標(biāo)記液相色譜-質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)方法對意大利杜洛克和大白豬肝臟的組織進(jìn)行分析，捕獲了501 種蛋白質(zhì)，挖掘出25 種可用于區(qū)分意大利杜洛克豬和大白豬的蛋白質(zhì)。Charoensin 等[24]采用核磁共振光譜法從泰國本土雞（TNC，100%泰國本土）、泰國合成雞（TSC，50%泰國本土）、泰國本土雜交雞（TNC 雜交，25%泰國本土）與商用肉雞（BR，0%泰國本土）的雞胸肉中鑒定了7 種差異代謝產(chǎn)物，包括丙氨酸、肌醇一磷酸、肌苷、鵝肌肽/肌肽、乳酸、鵝肌肽和肌酸。TNC、TSC 和 TNC 雜交雞胸腺中的鵝肌肽、鵝肌肽/肌肽比BR 顯著更高（P＜0.01）。Bovo 等[25]對母豬和去勢公豬進(jìn)行了相應(yīng)研究，通過靶向代謝組學(xué)的方法對其血漿進(jìn)行了檢測，共檢測出132 種小分子代謝物，其中85 種差異顯著，去勢公豬血漿中?；鈮A、生物胺等與脂肪沉積相關(guān)的小分子代謝物的豐度較高。

2.3 動物重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的代謝分子鑒定

代謝組既是基因組、轉(zhuǎn)錄組與表型之間的橋梁，也是基因組、轉(zhuǎn)錄組下游的表達(dá)產(chǎn)物。因此，代謝物既是生物體的表型，也調(diào)控著生物體的一切生命活動。代謝組能夠更直觀、更有效地反映出生物體自身的生理狀態(tài)。與表型數(shù)據(jù)相比，小分子代謝物檢測標(biāo)準(zhǔn)更容易統(tǒng)一，更容易進(jìn)行批量化的分析檢測，檢測數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。因此，利用代謝組學(xué)方法篩選與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的生物標(biāo)志物成為研究的重點(diǎn)。

在動物群體中，主要通過差異分析來篩選生物標(biāo)記物，此外通過代謝分子與重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析也可篩選生物標(biāo)記物，這種通過篩選生物標(biāo)記物進(jìn)行育種的方法可以提高育種過程中選擇的準(zhǔn)確性。Sun 等[26]對不同飼料飼養(yǎng)的泌乳奶牛體液進(jìn)行了代謝物檢測分析，在瘤胃液、血清、尿液、牛奶中分別發(fā)現(xiàn)了 55、28、31 和 8 種差異表達(dá)代謝物，這些差異代謝物主要集中在蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、酪氨酸代謝相關(guān)通路中，同時(shí)還可以作為生物標(biāo)記物，用于提高乳蛋白質(zhì)量及產(chǎn)奶量等。Shi等[27]通過超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QOrbitrap HRMS）技術(shù)獲得了地中海水牛、Murrah水牛和雜交水牛（Murrah 水牛×本地沼澤水牛）的牛奶代謝產(chǎn)物，鑒定出11 種差異顯著的小分子代謝物，這些差異代謝物主要在聚集在脂質(zhì)合成途徑中。Rohart 等[28]通過核磁共振技術(shù)對長白、大白和皮特蘭3個品種豬的血漿代謝物進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，乳酸、丙氨酸、β-丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、檸檬酸、肌酸酐等代謝物指標(biāo)與豬的瘦肉率密切相關(guān)，可以用作預(yù)測豬瘦肉率指標(biāo)的標(biāo)志物。Picone 等[29]檢測分析了長白豬、大白豬、杜洛克的初乳代謝物，認(rèn)為乳糖可以作為區(qū)分3個品種母豬的重要標(biāo)志物，同時(shí)確定?；撬?、醋酸鹽、二甲胺、順式-酸酯的水平與仔豬日增重和存活率密切相關(guān)。Welzenbach 等[30]對97 頭杜洛克×皮特蘭雜交豬的背最長肌樣品進(jìn)行代謝物和蛋白質(zhì)譜分析，總共定量了126 和35 種已經(jīng)注釋的代謝物和蛋白質(zhì)，鑒定出2 種與滴水損失強(qiáng)相關(guān)的代謝分子——磷酸甘油酸變位酶2 和甘氨酸。Stephane 等[31]利用氫核磁共振技術(shù)對高、低消化效率雜交雞血清、回腸、盲腸代謝組進(jìn)行分析，利用氮校正表觀代謝能（apparent metabolisable energy corrected to zero nitrogen retention,AMEn）來評估雞對飼料的消化效率，得出與AMEn 關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的代謝產(chǎn)物是血清中的脯氨酸、盲腸中的葡萄糖、回腸中的富馬酸鹽，這為雞飼料消化率預(yù)測提供新的思路。

2.4 代謝組與其他組學(xué)聯(lián)合分析研究應(yīng)用

目前，“突變-基因-調(diào)控-表達(dá)-代謝-表型”網(wǎng)絡(luò)在農(nóng)藝植物性狀研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[32]，而在農(nóng)用動物復(fù)雜性狀遺傳機(jī)制中的研究則正在興起。以小分子代謝物為表型數(shù)據(jù)，與基因組、轉(zhuǎn)錄組等進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以更加快速、準(zhǔn)確地識別出與肉質(zhì)、乳質(zhì)、生長性能相關(guān)的生物遺傳標(biāo)記物或發(fā)現(xiàn)遺傳規(guī)律，為農(nóng)用動物的分子育種提供了理論和技術(shù)支持。Sasago 等[33]通過日本黑牛背最長肌 mGWAS 分 析 篩 選 出STT3B、SUV420H1、CPT1A、MRPL21和IGHMBP2等與丙氨酸代謝相關(guān)的重要候選基因。Wang 等[34]利用LC-MS 技術(shù)，通過比較108 頭豬血漿（59 頭杜洛克豬和49 頭長白豬）篩選出45個代謝物，結(jié)合GWAS 關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn) 152個全基因組重要的 SNPs（P值＜1.06×10-6）與17 種代謝物相關(guān)聯(lián)，其中 90 種重要的SNPs 注 釋 到 52個 基 因 上 。 Viterbo 等[35]采 用Illumina Porcine 60K 芯片對480 頭純種杜洛克豬的背最長肌組織進(jìn)行基因分型，同時(shí)使用混合模型和回歸基因組控制法（GRAMMAR-GC）進(jìn)行全基因組快速關(guān)聯(lián)分析，篩選出GBF1、SCD、ABCC2、ELOVL3等一批與脂肪酸鏈合成長度相關(guān)的調(diào)控基因。Javanrouh-Aliabad 等[36]為了鑒定與代謝性狀相關(guān)的基因座，使用伊朗Urmia 本土雞和Arian 肉雞雜交的F2群體進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析研究，記錄了血漿甘油三酸酯、膽固醇、葡萄糖、總蛋白、白蛋白和球蛋白6個指標(biāo)，鑒定出候選基因DOCK10和AP1S3。Shi等[37]為了尋找影響雞腹水綜合征的差異表達(dá)基因和標(biāo)志代謝物，以腹水綜合征雞和抗腹水綜合征雞為研究對象，利用LC-MS 技術(shù)測定了血清代謝組，鑒定出15個生物標(biāo)志代謝物，結(jié)合肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析表明，甘油磷脂的代謝在抗腹水綜合征肉雞發(fā)育中起著重要作用。為了研究脂肪酸代謝在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，Xi 等[38]選取青海八眉豬和甘肅黑豬為研究對象，利用GC-MS 技術(shù)檢測了亞油酸、肉豆蔻酸、軟脂酸和硬脂酸4 種脂肪酸的代謝水平，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了與脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，然后進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)在G1（ENSSSCG000000 24681）和G2（ENSSSCG000000-36883）基因的調(diào)控下，八眉豬亞油酸的代謝水平顯著高于肉豆蔻酸、軟脂酸和硬脂酸，從而影響豬肉的品質(zhì)和口感。

2.5 代謝組學(xué)在動物醫(yī)學(xué)模型中的應(yīng)用

動物模型是動物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的工具，在人類疾病的研究中起著重要作用。由于在研究人類疾病時(shí)，必需經(jīng)過大量的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，又因?yàn)閭惱淼赖碌南拗埔约叭〔睦щy，無法在人體中直接開展，只能先依靠動物疾病模型進(jìn)行試驗(yàn)和評估。因此，適宜的動物模型對研究人類疾病具有重大的意義。小鼠具有繁殖能力強(qiáng)、生長周期短、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在多種人類疾病研究中均有應(yīng)用，而由于豬和人的生理狀態(tài)和代謝特征都比較相似，在人類疾病模型研究中的優(yōu)勢日益凸顯。Qiu等[39]通過超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測量了不同處理組大鼠血清和肝組織中的膽汁酸（bile acids, BAs）和游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）的代謝水平，通過生化分析得出黃芪湯劑和黃芪總苷可以通過改善膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核激素受體和膜受體來恢復(fù)BAs 和FFA 的代謝，從而對膽汁淤積性肝損傷具有保護(hù)作用。Nielsen等[40]利用LC-MS 方法研究了6 頭不同品種豬和15個人的血液代謝組，發(fā)現(xiàn)在飲食干預(yù)后，共檢測到的26種血液代謝物，其中有21種代謝物變化趨勢一致，這暗示著人和豬的營養(yǎng)代謝過程可能極為相似。Deng 等[41]通過代謝組學(xué)分析確定了7 種與睪丸激素缺乏引起的動脈粥樣硬化相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，它們在膽堿代謝、脂質(zhì)代謝、炎癥和氧化應(yīng)激中起著重要作用，證明了睪丸激素缺乏癥可能會加速高脂飲食誘導(dǎo)的小型豬的早期動脈粥樣硬化的進(jìn)展。Laserna 等[42]對創(chuàng)傷模型豬的代謝譜進(jìn)行分析，NMR 分析顯示了炎癥的急性期激活因子低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、載脂蛋白和白蛋白水平降低，LC-MS 分析揭示了炎癥反應(yīng)相關(guān)代謝物半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸和幾種甲基化代謝物的變化趨勢?？梢?，在疾病研究中，代謝組學(xué)技術(shù)可以快速有效地進(jìn)行評估。

3 結(jié)語

目前，代謝組學(xué)研究已廣泛應(yīng)用于疾病預(yù)測、藥物設(shè)計(jì)、畜禽產(chǎn)品安全檢測等領(lǐng)域。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，此技術(shù)將更廣泛地應(yīng)用于豬、牛、羊等家養(yǎng)動物的選育中，比如通過指定生理狀態(tài)標(biāo)記的代謝小分子選育動物，或者通過某些代謝組學(xué)信息對動物潛在的遺傳差異進(jìn)行分析，這對闡明機(jī)體復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制非常有利。但是，代謝組學(xué)研究還有許多未解決的問題，比如外界環(huán)境因素的影響、技術(shù)的局限性、數(shù)據(jù)庫的建立等。首先，影響生物體內(nèi)代謝物變化的因素很多，如生理刺激、遺傳因素、環(huán)境因素均對代謝物有很大的影響。因此，在代謝組學(xué)的研究中應(yīng)充分考慮外界環(huán)境以及生物體內(nèi)環(huán)境的變化是否會影響其研究結(jié)果；其次，代謝組學(xué)平臺還不完善，存在儀器靈敏度低、檢測覆蓋范圍小等局限性，只能檢測出的一部分代謝分子，鑒定出的代謝物更少，僅代表少部分基因變異；另外，代謝組學(xué)分析過程中會產(chǎn)生大量的圖譜數(shù)據(jù)，這需要結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)、生物信息等各種技術(shù)提取圖譜數(shù)據(jù)信息，但由于相關(guān)研究方法仍不夠成熟，如何從復(fù)雜的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中提取出有效的信息、篩選出有價(jià)值的潛在生物標(biāo)志物是研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析將成為未來研究的熱點(diǎn)，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫的完善和發(fā)展也將有助于各種組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析。