基于分子證據確認秦嶺藤屬與駝峰藤屬(夾竹桃科)的系統位置

廖 苗， 曾思金， 唐光大,3*

( 1. 華南農業大學 林學與風景園林學院， 廣州 510642； 2. 中國科學院華南植物園 植物資源保護與可持續利用重點實驗室 廣東省數字植物園重點實驗室， 廣州 510650； 3. 韶關學院 英東生物與農業學院， 廣東 韶關 512005 )

夾竹桃科(Apocynaceae)在Angiosperm Phylogeny Group IV系統(APG IV)中與鉤吻科(Gelsemiaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、馬錢科(Loganiaceae)和茜草科(Rubiaceae)共同屬于龍膽目(Gentianales)(Chase et al., 2016)，包含傳統界定的狹義夾竹桃科(Apocynaceaes.s.)和蘿藦科(Asclepiadaceae)兩大類群，約5 350種，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(Endress et al., 2018)。夾竹桃科目前已建立了相對穩定的分子演化系統(Fishbein et al., 2018)，一些修訂的屬作了歸并或位置調整，目前總屬數由422個(Endress & Bruyns， 2000)縮減到378個(Endress et al., 2018)。

白前屬(VincetoxicumWolf)隸屬于夾竹桃科馬利筋族(Asclepiadeae)娃兒藤亞族(Tylophorinae)，范圍變化較大(Endress et al., 2018)。傳統的白前屬通常莖直立，少數上部纏繞，須根簇生，花冠輻狀，有5個肉質的副花冠裂片，乳汁透明(邱聲祥等，1989；Liede, 1996)。白前屬與鵝絨藤屬(CynanchumL.)具有相似的副花冠、合蕊柱、花粉器等特征，部分學者認為白前屬應歸并在鵝絨藤屬中(蔣英和李秉滔，1977；Forster, 1991；Li et al., 1995)，但有學者認為白前屬應作為獨立的屬(Markgraf, 1972；Ali & Khatoon, 1982)。邱聲祥等(1989)結合化學成分、形態、染色體數目和分布區等證據，提出白前屬應從鵝絨藤屬中獨立出來，Liede(1996)基于形態與化學證據也支持該觀點，并認為其與娃兒藤屬(TylophoraR. Br.)的關系最近。

然而，分子系統學研究顯示白前屬與鵝絨藤屬親緣關系較遠(Liede, 2001；Rapini et al., 2007)，支持白前屬與娃兒藤屬關系更近，但它們都是非單系的，而秦嶺藤屬(BiondiaSchltr.)、BlyttiaArn.、DiplostigmaK. Schum.、GoyderaLiede、PleurostelmaBaill.和RhyncharrhenaF. Muell.6個屬都嵌套在Vincetoxicum-Tylophora分支中(Liede-Schumann et al., 2012，2016)。娃兒藤屬和上述6個屬，以及形態上相近的一些屬均被歸并在白前屬中，增加了大量的新組合或新名稱(Kidyoo & Kidyoo, 2018；Liede-Schumann & Meve, 2018；Hsu et al., 2021；Shah et al., 2021)。原主要分布在中國的3個屬，即駝峰藤屬(MerrillanthusChun & Tsiang)、白水藤屬(PentastelmaTsiang & Li)和箭藥藤屬(BelostemmaWall. ex Wight)也歸并在白前屬中。新定義的白前屬有150多種，通常有透明乳汁；花小，花冠輻狀，少數鐘狀、壇狀、長圓錐狀；副花冠由肉質分離的雄蕊上的裂片組成，或由合生的雄蕊和片狀的雄蕊間的部分組成環狀；花粉塊柄直立、水平或斜上，分布于熱帶、亞熱帶非洲、亞洲、歐亞大陸等區域(Endress et al., 2018)。

秦嶺藤屬約13種，是中國特有屬，分布于我國東部和西南部；駝峰藤屬僅有駝峰藤(MerrillanthushainanensisChun et Tsiang)1種，分布于我國的廣東、海南以及柬埔寨(蔣英和李秉滔，1977；Li et al., 1995)。在Liede-Schumann等(2012, 2016)的系統發育分析中，秦嶺藤屬包含2個種，即黑水藤(BiondiainsignisTsiang)和青龍藤 [B.henryi(Warb. ex Schltr. et Diels) Tsiang et P. T. Li]的樣品，缺少屬的模式秦嶺藤(B.chinensisSchltr.)的樣品，同時缺乏駝峰藤屬的樣品。部分學者報道了秦嶺藤與駝峰藤的葉綠體基因組數據，并進行了簡易的系統發育分析，其中秦嶺藤顯示與Vincetoxicumrossicum(Kleopow) Barbar.是姐妹類群，但系統樹中僅包含白前屬1個種的數據(Rao et al., 2018)；駝峰藤則顯示與黑水藤是姐妹類群，但系統發育樹中的取樣太少(Xiong et al., 2019)，這2個種是否屬于白前屬，或屬于白前屬哪個分支等問題依舊不清楚。

本研究收集了秦嶺藤與駝峰藤的數據，其中新增駝峰藤的分子測序，秦嶺藤的數據參考使用Rao等(2018)的測序結果，并結合白前屬其他物種的分子數據(Liede-Schumann et al., 2016)，開展了系統發育分析，擬進一步明確這2個屬的系統位置和歸屬。

1 材料與方法

1.1 類群取樣和分子序列數據來源

秦嶺藤(憑證標本：ZJB-2017-152-1，保存于陜西師范大學)數據來自Rao等(2018)中的淺層測序基因數據。對駝峰藤(憑證標本：LHB-AP17，保存于華南農業大學)進行葉片取樣，經硅膠干燥后，將樣品放入干冰中冷藏，快遞至北京諾禾致源生物有限公司武漢分公司進行基因組總DNA的提取、小片段文庫的建庫與測序。具體操作如下：首先，DNA經檢測合格后，先隨機打斷為350 bp左右的文庫，再進行PE150雙端測序，得到原始數據(raw data)，經質控后得到最終的有效數據(clean data)10 Gb。然后，將秦嶺藤的已有淺層測序數據與本次測序的駝峰藤的數據用GetOrganelle 1.7(Jin et al., 2020)進行組裝，設置參數為默認；使用Bandage 0.8(Wick et al., 2015)和Geneious Prime 2019(https://www.geneious.com/)對組裝得到的fastg文件進行可視化和序列提取，得到最終的秦嶺藤的核糖體基因組序列，以及駝峰藤的葉綠體基因組與核糖體基因組序列。最后，分別以無油樟[AmborellatrichopodaBaill.(AJ506156)]和羅布麻[ApocynumvenetumL. (MT313688)]的葉綠體基因組作參考，先利用Plastid Genome Annotator(PGA)(Qu et al., 2019)對駝峰藤的葉綠體基因組進行注釋，再根據log文檔在Geneious Prime 2019中作進一步的手動校正，得到葉綠體基因組的注釋信息；以AsclepiascoulteriA.Gray(JN665084)的核糖體基因組nrDNA連續片段(18S+ITS1+5.8S+ITS2+26S)和Vincetoxicumbiglandulosum(Endl.) Kuntze(LN880610)的核糖體基因序列片段(ETS)為參考，在Geneious Prime 2019中對秦嶺藤與駝峰藤的核糖體基因組進行注釋，并利用Excract選項提取出所需的核糖體基因序列片段與葉綠體基因序列片段，并將數據上傳至GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

基于已發表的娃兒藤亞族分子系統學研究數據(Liede-Schumann et al., 2016)，補充駝峰藤和秦嶺藤的DNA數據，選取鵝絨藤亞族(Cynanchinae)中的3個種為外類群，分別利用5個葉綠體基因序列片段(psbA-trnH、trnG、trnL、trnL-F、trnT-L)(137個種)、2個核糖體基因序列片段(ETS、ITS)(136個種)，以及二者的合并數據構建系統發育樹(139個種)。序列詳細信息見表1，樣品憑證標本詳細信息見文獻Liede-Schumann等(2016)。部分樣品序列數據不全，相關序列矩陣中以缺失數據形式補齊。

1.2 序列比對和拼接

采用MAFFT軟件(Katoh & Standley, 2013)單獨對每個片段進行序列比對，多片段數據在Geneious Prime 2019中進行序列拼接，得到聯合矩陣數據。

1.3 系統發育分析

首先，利用IQ-TREE(Nguyen et al., 2015)基于最大似然法(maximum likelihood method, ML)對序列進行系統發育分析，IQ-TREE中ModelFinder按照BIC準則(Bayesian Information Criterion, BIC)自動測試，并選擇出最佳替代模型，其中核糖體基因序列片段合并數據使用模型為TVM+F+R3、葉綠體基因序列片段合并數據使用模型為K3Pu+F+R3、核糖體與葉綠體基因序列片段合并數據使用模型為TVM+F+R3；然后，進行1 000次的SH-aLRT檢驗(Guindon et al., 2010)和超快自展值檢驗(ultrafast bootstrap approach, UFboot)(Minh et al., 2013)，每個分支含有SH-aLRT和UFboot 2個支持率，如果SH-aLRT≥80%且UFboot≥95%，則視為得到較好支持，其分支結果可信；最后，將所得系統樹在Figtree 1.4.2(Rambaut, 2012)中查看。

表 1 取樣物種和序列GenBank編號Table 1 List of taxa sampled and GenBank accession numbers of sequences

續表1

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2 結果與分析

基于核糖體基因序列片段(ETS、ITS)構建的系統發育樹顯示，娃兒藤亞族中白前屬是非單系的，PentatropisR. Br. ex Wight & Arn.嵌套在白前屬中，并與Vincetoxicumapiculatum+V.sylvaticum+V.tenuipedunculatum成姐妹分支，支持率分別為SH-aLRT=82.8%、UFboot=82%(82.8/82)(圖1)；基于葉綠體基因序列片段以及合并數據構建的系統樹都顯示娃兒藤亞族分為2個大分支，PentatropisR. Br. ex Wight & Arn.與白前屬呈姐妹關系，支持率分別為99.8/100、99.9/100(圖2，圖3)。

分支節點數據代表SH-aLRT和UFboot 2個支持率，SH-aLRT≥80%且UFboot≥95%，視為結果可信，分支的劃分參照Liede-Schumann 等(2016)。下同。Each branch assigned with SH-aLRT and UFboot supports, if SH-aLRT≥80% and UFboot≥95%, the result is considered to be credible, clade designations follow those of Liede-Schumann et al. (2016). The same below.圖 1 基于2個核糖體基因序列片段 (ETS、ITS) 構建的娃兒藤亞族的系統發育樹Fig. 1 Phylogeny tree of Tylophorinae constructed by two ribosomal gene sequence fragments (ETS, ITS)

圖 2 基于5個葉綠體基因序列片段(psbA-trnH、trnG、trnL、trnL-F、trnT-L)構建的娃兒藤亞族的系統發育樹Fig. 2 Phylogeny tree of Tylophorinae constructed by five plastid gene sequence fragments (psbA-trnH, trnG, trnL, trnL-F, trnT-L)

圖 3 基于5個葉綠體基因序列片段(psbA-trnH、trnG、trnL、trnL-F、trnT-L)和2個核糖體基因序列片段(ETS、ITS)構建的娃兒藤亞族的系統發育樹Fig. 3 Phylogeny tree of Tylophorinae constructed by five plastid gene sequence fragments (psbA-trnH, trnG, trnL, trnL-F, trnT-L) and two ribosomal gene sequence fragments (ETS, ITS)

3組分子矩陣數據所建系統樹都高度支持駝峰藤屬與V.cissoides(Tylophoracissoides)和V.philippicum(T.parviflora)聚為一支，圖1、圖2、圖3中支持率分別為100/100、97.9/100、100/100；秦嶺藤屬中的3個種均嵌套在白前屬分支中，但在系統樹中非單系，其中在基于核糖體基因序列片段(ETS、ITS)所建的系統樹與合并數據所建的系統樹中，秦嶺藤與青龍藤V.henryi(Biondiahenryi)互為姐妹類群，支持率分別為97.7/100、97.8/100(圖1，圖3)，并與V.kawaroense(T.japonica)聚為一支，支持率分別為97.1/100、97.8/100，在基于葉綠體基因序列片段構建的系統樹中，秦嶺藤與青龍藤聚為一支，但支持率較低(31.3/67)(圖2)，而黑水藤在3組系統樹中均顯示在亞熱帶分支(Subtropical Clade)中(圖1、圖2、圖3中支持率分別為100/100、93.8/100、100/100)，并與V.villosum(T.villosa)聚為一支(圖1、圖2、圖3中支持率分別為74.3/100、0/96、72.6/100)。

3 討論與結論

3.1 秦嶺藤屬的系統發育與屬級分類地位

在秦嶺藤屬建立時，Schlechter(1905)指出其花粉塊下垂，與牛奶菜屬(MarsdeniaR. Br.)的直立花粉塊存在明顯差異；花冠壇狀或近鐘狀，與娃兒藤屬的花冠5深裂、輻狀或廣輻狀有別，并認為秦嶺藤屬應放在馬利筋亞族(Asclepiadinae)中。Gilbert等(1995)認為秦嶺藤屬的特點是葉狹窄，葉正面具有微小的蒼白點，花小，花冠縮小，通常呈環狀，花冠管多數較發達，并觀察到娃兒藤屬的一些種也有相似的蒼白點，說明秦嶺藤屬與娃兒藤屬形態性狀存在交叉現象。娃兒藤屬已被歸并至白前屬中(Liede-Schumann et al., 2012；Liede-Schumann & Meve, 2018；Endress et al., 2018)，本研究的分子系統結果支持秦嶺藤屬歸并入白前屬的分類處理。

本研究分子系統分析結果顯示，秦嶺藤屬的3個種都在白前屬內，其中秦嶺藤與青龍藤聚為一支，而黑水藤與V.villosum(T.villosa)聚為一支，并在亞熱帶分支中，但它們在形態上差異較大，黑水藤的枝、葉柄均被單列短柔毛，葉線狀披針形，除葉面中脈被微毛外，無毛，花冠近鐘狀，無毛，而V.villosum的枝、葉柄均密被柔毛，葉卵形或卵狀長圓形，兩面具毛，花冠輻狀，具長柔毛；地理分布方面，前者分布于我國貴州、湖南、四川、西藏和云南(Li et al., 1995)，后者分布于爪哇島(Backer & Bakhuizen, 1965)。有關黑水藤與近緣種在形態和地理分布上差異較大，但親緣關系較近的情況尚需進一步采集更多樣品開展深入探究。

3.2 駝峰藤屬的系統位置與屬級分類地位

駝峰藤屬在發表時被認為與徐長卿屬(PycnostelmaBunge ex Decne.)最相近(Chun & Tsiang, 1941)，后者現已被歸并至白前屬中(Liede-Schumann & Meve, 2018)，兩者的副花冠都貼生于雄蕊，它們在生活型、副花冠裂片的形狀、花冠裂片生長樣式和果實形狀大小等方面存在明顯區別，其中駝峰藤屬為木質藤本，副花冠裂片背部隆起，基部增厚，花冠裂片連生，未開花時裂片頂端向內連生，蓇葖果單生，紡錘形，大型；而徐長卿屬為直立草本，副花冠向先端加厚，花冠深裂，果實披針形，較小(Chun & Tsiang, 1941)；駝峰藤屬的花冠裂片與醉魂藤屬(HeterostemmaWight & Arn.)和球蘭屬(HoyaR. Br.)類似，其膜質心形葉片與夜來香屬(TelosmaCoville)相似，駝峰藤屬的花粉塊下垂，另3個屬的花粉塊直立，可以明顯區分(Chun & Tsiang，1941)。蔣英和李秉滔(1977)發現駝峰藤屬與印度產的原IphisiaWight & Arn=VincetoxicumWolf較相近，不同之處在于駝峰藤屬的花冠裂片端部未開放時互相粘合，花粉塊柄斜行上升，且花粉塊完全倒垂，而Iphisia的花粉塊柄先橫平，次上升，后斜下。駝峰藤屬的花部結構與宜昌娃兒藤 [T.augustiniana(Hemsl.) Craib=V.augustinianum(Hemsl.) Meve & Liede]十分相似，但駝峰藤屬的花更大。此外，由于駝峰藤屬的蓇葖果大(長9～12 cm，直徑3.5～4 cm)，有較厚的纖維狀中果皮，而娃兒藤屬通常果皮薄，具有紙質的蓇葖果壁，因此駝峰藤屬被保留為獨立的屬(Gilbert et al., 1995)。本研究未收集到宜昌娃兒藤的數據，但研究結果顯示駝峰藤屬與其他2個娃兒藤屬V.cissoides(T.cissoides)和V.philippicum(T.parviflora)聚為一支，這2個種果實均較大(前者長10～12 cm，直徑3～5 cm；后者長13～15 cm，直徑3～4 cm)，葉大小與葉形與駝峰藤屬很相似；地理分布上，V.cissoides廣泛分布于印度尼西亞東部和新幾內亞(Forster, 1994)，V.philippicum僅分布于菲律賓(Meve et al., 2002)，而駝峰藤屬分布于我國的廣東、海南以及柬埔寨(Li et al., 1995)。因此，僅憑果實大小、花粉塊柄的生長方式、葉子的形狀與大小作為娃兒藤亞族內屬的鑒別特征可能并不夠充分，但這些特征可作為白前屬內種間的鑒別特征。依據花粉塊下垂的特征，駝峰藤屬在最初建立時被置于馬利筋族馬利筋亞族中(Chun & Tsiang, 1941)，自Endress和Bruyns(2000)合并夾竹桃科與蘿藦科后，該屬也被置于馬利筋族中，但先后被置于鵝絨藤亞族(Endress et al., 2007)和娃兒藤亞族中(Endress et al., 2014；Endress et al., 2018)。本研究支持當前駝峰藤屬歸并至白前屬，并放置在娃兒藤亞族中。

3.3 白前屬的系統發育

雖然基于核糖體基因序列和葉綠體基因序列合并數據的系統發育分析顯示白前屬為單系，但其含有的信息位點依舊較少，白前屬屬內的種間系統發育關系支持率較低。基于高通量測序的系統發育分析將更清晰地重建白前屬的系統發育分支關系。由于白前屬的分類變動較大，因此非常有必要基于基因組學研究結果與形態特征分析進行全面的分類學修訂。

致謝承蒙廣東中山樹木園廖浩斌老師在樣品采集上提供幫助，陜西師范大學鄒嘉賓老師提供分子數據，以及武漢植物園張彩飛老師協助數據獲取，特此致謝。