結核病免疫學檢測方法的研究進展

盧珮

（崇左市人民醫院，廣西 崇左，532200）

結核病作為全球性公共健康問題，截止至2020 年，全球新發結核病例數高達700 萬例。成功診斷、治療可促使每年上百萬結核病患者避免死亡，但最新數據顯示[1]，據統計2000～2020 年可避免5400 萬人死亡。當前對結核病檢出持續存在一定漏洞。目前結核分枝桿菌特異性抗原分析特點為簡單、成本低、操作方便及測定快速等優點，成為篩查結合病例有利方法，特別為中國、印度等資源受限國家[2]。目前對結核病診斷血清學研究領域中，國內外學者致力于尋找在結核病患者中能引起強烈抗體反應潛在血清診斷抗原，而新型結核病免疫學實驗室檢測技術不斷出現。文章就對近些年來國內外結核病免疫學實驗室檢測方面技術進展如下分析，以促進優良實用的結核病診斷新技術在我國各級醫療機構普及應用，現報道如下。

1 結核菌素皮膚試驗（TST）

TST 為一項遲發型超敏反應免疫試驗。而結核菌素作為結核分枝桿菌代謝產物，可引起特異性反應。包括舊結核菌素、純蛋白衍生物兩種。Koch 發明舊結核菌素，從結核菌培養基提取，含有結核蛋白外并包括培養基及菌體等成分[3]。純蛋白衍生物則是由Seibert 制備，包括結合蛋白，依據制取來源并分為數種。通過一定量PPD 經皮注射至體內，觀察局部皮膚紅腫硬結程度并判斷反應強度[4]。當前認為TST 對活動性結核病及潛伏性結核感染診斷價值高。同時，伴隨著現階段卡介苗接種范圍擴大，上述試驗結果陽性并非可直接確診為結核病，降低結核菌素試驗陽性率。研究指出[5]，結核菌素試驗相比較其他檢測手段，陽性率高達76.5%，靈敏度為88.2%，特異性低至34.4%，表明TST 具有較高假陽性率。同時，種類不同PPD 試驗結果也存在著不同。但TST 低廉、方便及快速特點下，成為欠發達地區結核病檢測主要手段。

2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA 法）

ELISA 原理是指抗原或抗體吸附在特殊固相載體表面，吸附于載體上抗原或抗體會保留原有免疫活性，隨后添加樣本，并對樣本中受檢物質與固相化物質因特異性的抗原抗體反應而相互結合。加入受檢物質后并依據洗板除去非特異性結合物，添加既有酶活性又有免疫學活性酶標記抗原及抗體。再次洗板并添加底物與酶反應顯色后，利用酶標儀讀取酶標板孔中光密度值，依據光密度值并定性、定量分析。實驗表明融合性的MPT64-Rv1985c 抗原可有效鑒別活動性肺結核、潛伏感染者，ESAT-6 可區分BCG 接種者及結核菌感染者。同時上述方式應用上有一定局限性，抗原抗體反應時，會因個體差異、邊緣效應、抗原本身濃度及PH 等因素對兩者結合效率造成影響。結核特異性抗原ELISA 檢測靈敏度為60%～85%，特異度為80%～95%[6]。敏感性范圍變化上，反應酶聯免疫吸附試驗不穩定性。快速、簡便、準確血清學免疫診斷方式應用上受到臨床廣泛關注，可作為ELISA 發展指明方向。

3 斑點免疫膠體金滲濾法（TB-DOT）

TB-DOT 原理是采取斑點免疫膠體金滲濾技術并將提純的Mtb 特異性膜蛋白作為抗原，降低固定于硝酸纖維膜上，并將含有抗外膜蛋白抗體被檢血清標本時，在毛細管層析作用下與特定抗原結合，加入吸附作用膠體金顆粒，依據反應是否出現紅色斑點判斷是否感染結核病[7]。當前特異性膜蛋白應用上包括MPB64、ESAT-6、14kD 等抗原。結核分枝桿菌抗體檢測中膠體金免疫層析法應用期間具有顯著優勢，如耗費時間短、成本低以及操作簡便等，被廣泛用于大樣本量篩查中，但仍然存在一定假陽性、假陰性。報道提示[8]，對結核抗體檢測敏感性、特異性分析上為10%～90%、47%～100%，而不同研究上試劑、方法之間有一定差異性[9]。因此，上述檢測項目歸為一類輔助診斷方式，配合痰細菌學、影像學及臨床表現等，可提高臨床結核病診斷率，協助應用于早期診斷中，可指導患者擬定出合理治療方案，改善結核病患者預后。

4 結核感染T 細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）

T-SPOT.TB 定義：利用機體T 淋巴細胞并受到毒力的TBAg刺激后，活化分泌結核分枝桿菌特異性γ干擾素效應T 細胞，并檢測、計數效應T 細胞數量，用于評估機體是否感染結核分枝桿菌[10]。試驗中，TBAg 可作為致病結核分枝桿菌RD1 區上Rv3874 編碼的培養濾液蛋白10、Rv3875 編碼的早期分泌靶向抗原6。研究指出[11]，T-SPOT.TB 試驗下，對378 例結核分枝桿菌培養陽性患者、824 例體檢健康者檢測結果得出，T-SPOT.TB結果下，陽性診斷活動性結核敏感性、特異性維持在91.0%、75.2%。對結果深度分析結果得出，依據TBAg/植物血凝素斑點數的比值并對活動性結核、潛伏性結核感染區分，整體效果優于T-SPOT.TB 斑點技術對陽性結果判斷，并對該項比值診斷肺外結核時有一定參考價值[12]。伴隨著近些年來T-SPOT.TB 不斷更新、應用，新型T 細胞檢測技術（ELISPOT-IL-2 技術）廣泛應用，基于T-SPOT.TB 基礎上，以原核表達結核分枝桿菌標準菌株PPE36-p27 蛋白為刺激原，可刺激機體產生細胞因子IL-2，并通過固相載體上包被的抗人IL-2 單克隆抗體，后加入生物素標記IL-2 單克隆抗體，分別結合后并添加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，形成固相抗人IL-2 單克隆抗體-待測抗原-生物素標記IL-2 單克隆抗體-HRP 標記的鏈霉親和素復合物，洗滌后顯色，并對形成斑點觀察。伴隨著T-SPOT.TB 多種改進技術在后期進一步優化，被用于結核病診療，上述新方法中仍需進一步深入研究。

5 蛋白芯片技術

蛋白芯片技術定義：將不同目標蛋白質依據預先設置排列順序固定于各種載體表面，并做成微陣列檢測芯片，分析抗原抗體高度特異性結合特點，并對特定熒光物質的針對芯片上蛋白質TBAg 或抗體與檢測芯片反應，洗滌并去除未與芯片上蛋白質特異性結合熒光抗原、抗體后，利用激光共聚掃描技術、熒光掃描儀檢測芯片上各點熒光強度，依據熒光強度，并分析各種待測樣本中蛋白質。目前蛋白質芯片被用于尋找新藥作用靶點、腫瘤標志物檢測及科研等方面[13]。研究指出[14]，蛋白質芯片篩選腦脊液120 種細胞因子，并檢測83 種細胞因子，分析62 例患者腦脊液因子含量，可得出γ-干擾素、白介素-8 及單核細胞趨化蛋白-2 作為結核性腦膜炎診斷性細胞因子。研究指出[15]，蛋白質芯片檢測420 例結核病患者血液標本，結果顯示，涂陽肺結核陽性率76.15%，結核蛋白質芯片固定TBAg 蛋白16000、38000、結核分枝桿菌特異性細胞壁脂多糖抗原三抗體聯合檢測下，結核病陽性率、診斷準確率顯著提升，被用于結核病診斷中有一定輔助價值。但近些年來結核蛋白質芯片法作為一類新型研究方式，對臨床診斷、療效評估及科學研究仍需進一步分析。

結核病免疫學檢測手段日趨豐富，多種免疫檢測方式應用及聯合成為結核病診斷新趨勢。但目前臨床應用有一定局限性，精確、可靠及快速及低廉檢測手段仍需探索設計。同時，部分免疫學檢測仍需臨床大規模探索驗證，才能不斷改良及完善。盡管針對結核病免疫學檢測發展過程中仍然面臨挑戰，但伴隨著結核病免疫學機制研究及生物學發展不斷深入，結核病免疫檢測被廣泛應用，對結核病早診斷、早干預及早治療具有重要意義。總的來說，結核病免疫學檢測對結核病防治意義深遠，同時仍需科學家發現更加有效檢測方法。