環孢素A個體化用藥臨床預后的實驗室檢查指標研究進展Δ

胡錦煒，朱懷軍，勞茜瑩，2，李丹瀅#（.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥學部，南京 20008；2.南京中醫藥大學中西醫結合鼓樓臨床醫學院，南京 20008）

環孢素A是從致病真菌多孔木霉中分離得到的具有抗真菌活性的化合物[1]，具有免疫抑制作用[2]。1983年，美國FDA批準環孢素A用于預防和治療器官移植后的排斥反應。目前，環孢素A主要應用于腎移植、肝移植、心臟移植等，提高了器官移植患者的生存率[3]。除器官移植外，環孢素A也廣泛應用于系統性紅斑狼瘡、銀屑病、干燥綜合征以及免疫性血小板減少癥等自身免疫疾病的治療[4-8]。然而，環孢素A在有著強大免疫抑制作用的同時，也存在一些毒性反應，包括肝腎毒性、心血管毒性以及神經毒性等，嚴重時甚至危及患者生命[9]。由于環孢素A治療窗狹窄，臨床使用時通常需進行治療藥物濃度監測，根據患者服用環孢素A前和用藥后2 h的血藥濃度調整給藥劑量，以提高用藥的安全性與有效性[10]。但由于環孢素A存在明顯的個體間代謝差異，臨床實踐及相關文獻均提示，部分血藥濃度在治療窗內的患者仍然療效不佳甚至還出現了毒性反應[11]。該現象提示，目前臨床常規使用的血藥濃度監測方法并不能完全反映環孢素A的臨床預后，探索更有效的臨床個體化用藥指標意義重大。

環孢素A通過血液循環進入淋巴細胞，抑制淋巴細胞內鈣調磷酸酶（calcineurin，CN）活性，使淋巴細胞功能發生改變，從而對機體發揮免疫抑制作用[12]。在此基礎上，本文結合臨床研究現狀，圍繞外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）內環孢素A濃度、CN活性和T細胞功能以及環孢素A代謝物濃度4個方面，綜述其與環孢素A臨床預后的相關性，以期尋找潛在的個體化用藥指標，彌補環孢素A臨床常規血藥濃度監測的不足，為環孢素A個體化治療提供臨床應用依據。

1 PBMCs內環孢素A濃度與環孢素A臨床療效的相關性

環孢素A進入血液循環后，部分與T細胞結合發揮治療作用。國內外已有多個研究提出，測定淋巴細胞內環孢素A濃度能更好地反映臨床療效[13-17]。由于T細胞內環孢素A濃度較低，對測定方法的特異性與可靠性有較高的要求，相比之下，測定PBMCs內環孢素A濃度的可行性更高[13]。在器官移植領域也已有專家共識表示，測定PBMCs內環孢素A濃度可以作為補充全血治療藥物監測不足的工具，優化器官移植患者的個體化治療[14]。Falck等[15]將20名腎移植患者的環孢素A血藥谷、峰濃度和T細胞內濃度作為研究對象。結果發現，在20名發生和未發生排斥反應的患者中，其環孢素A給藥劑量差異和血藥峰濃度差異均無統計學意義；而T細胞內環孢素A濃度在患者發生排斥反應的1周前開始出現逐漸下降，特別是在發生排斥反應的3 d前，T細胞內環孢素A濃度出現明顯下降。Crettol等[16]對41名腎移植患者、20名肝移植患者以及3名肺移植患者的全血環孢素A谷濃度和PBMCs內環孢素A濃度同時進行了監測，結果發現，2種監測結果的相關性較弱。該研究進一步根據患者的ABCB1基因型進行分組，研究ABCB1單核苷酸多態性對環孢素A血藥濃度以及PBMCs內環孢素A濃度的影響。ABCB1是編碼P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的基因，P-gp可以將細胞內藥物泵出，降低藥物濃度，從而影響藥物療效[17]。該研究結果發現，不同ABCB1基因多態性會影響P-gp轉運活性，從而導致PBMCs內環孢素A濃度發生改變；同時還發現，對于攜帶不同ABCB11199G＞A基因型的患者，環孢素A血藥濃度差異無統計學意義，但其PBMCs內環孢素A濃度差異有統計學意義（P＜0.05）。這也進一步解釋了環孢素A個體差異較大的原因[16]。Barbari等[18]將35名腎移植患者分為3組，分別為發生過急性排斥反應組（n＝7）、發生過腎毒性反應組（n＝5）和移植器官功能正常組（n＝23），分別測定其環孢素A血藥谷、峰濃度以及PBMCs內谷、峰濃度。結果發現，3組患者的環孢素A血藥谷、峰濃度差異無統計學意義，而移植器官功能正常組患者的PBMCs內環孢素A谷、峰濃度明顯高于發生過急性排斥反應組和發生過腎毒性反應組，且差異均有統計學意義[18]。這個研究再一次說明，相較于監測環孢素A全血藥物濃度，監測器官移植患者PBMCs內環孢素A濃度更能有效地反映臨床預后情況。此外，2020年已有專家共識總結了較為系統的PBMCs內環孢素A濃度的測定方法及步驟，進一步提高了這種監測方法應用于臨床的可行性[14]。

2 PBMCs內CN活性與環孢素A臨床療效的相關性

CN是一種可以調節活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）核移位和活化的蛋白。環孢素A與T細胞內親環素結合所形成的復合物可以與CN結合并抑制CN活性，從而發揮免疫抑制作用[12]。目前關于PBMCs內CN活性的研究多集中于器官移植領域，探索其與環孢素A藥動學以及排斥反應發生的相關性。一項關于異基因干細胞移植的研究對31名患者進行了CN活性的測定，其中有18名患者發生Ⅱ級甚至更嚴重的移植物抗宿主反應（graft versus-host reaction，GVHR），且發生GVHR患者的PBMCs內CN活性顯著高于未發生GVHR患者[19]。在移植后2個月的跟蹤隨訪中發現，在發生GVHR的18名患者中，8名患者在移植后21 d內發生GVHR，其中有6名患者出現CN活性超過28.5 pmol/（min·mg pro）的現象；10名患者在移植21 d后發生GVHR，其在排斥反應發生之前均出現CN活性超過28.5 pmol/（min·mg pro）的現象。這表明CN活性的增強與GVHR的發生密切相關。該研究還發現，在GVHR發生前后，患者的環孢素A血藥谷濃度并無明顯變化，環孢素A血藥谷濃度與CN活性之間也沒有相關性，該結論與另一項關于腎移植的研究相似[20]。Fukudo等[21]研究發現，接受環孢素A治療的肝移植患者的CN活性隨著環孢素A血藥濃度達峰值后迅速下降，其中未發生排斥反應的患者的CN活性低于發生排斥反應的患者；在環孢素A達峰濃度或谷濃度時，未發生排斥反應的患者的CN活性一直維持在20 pmol/（min·mg pro）以下。該研究對比了另一種CN抑制劑他克莫司血藥濃度與CN活性及藥效學的相關性，結果發現，與環孢素A的相同之處在于，出現排斥反應的患者的他克莫司血藥谷濃度較低，CN活性較高；與環孢素A的不同之處在于，出現腎毒性反應的患者的他克莫司血藥谷濃度較高、CN活性較低，而在使用環孢素A的患者中，發生或未發生腎毒性反應的患者的CN活性差異無明顯變化。Pai等[22]研究也發現，服用環孢素A的患者PBMCs內CN活性比未服用環孢素A的健康志愿者低。但與其他研究不同之處在于，這些服用環孢素A的患者中，發生GVHR的患者PBMCs內的平均CN活性為0.5 pmol/min，明顯低于未發生排斥反應的患者（平均CN活性為1.0 pmol/min）。這些較低水平的CN活性可能繼發于較高水平的環孢素A，即為了治療GVHR而服用較高劑量環孢素A的結果。該項研究也顯示，雖然環孢素A發揮藥理作用可以持續抑制CN活性，但抑制CN活性并不能控制GVHR的發生，可見GVHR的作用機制可能不止CN活性改變這一條通路。

3 T細胞功能變化與環孢素A臨床療效的相關性

有研究表明，環孢素A可抑制CN活性，阻止NFAT去磷酸化，最終導致T細胞功能減弱，表現為細胞因子表達水平降低、T細胞的增殖與活化受到抑制[23]。由此可見，監測T細胞功能變化有助于了解環孢素A生物學效應信息。目前的研究主要通過測定增殖細胞核抗原、細胞因子[如白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）、IL-4、IL-5、IL-2R、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、干擾素 γ（interferon γ，IFN-γ）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等]以及NFAT殘留基因表達（NFAT regulated gene expression，NFAT-RGE）等來監測T細胞功能[24]。一項關于特發性蕁麻疹患者的研究顯示，使用環孢素A治療的患者臨床癥狀均明顯減輕，其中70%的患者達到完全緩解；同時該研究還監測到，與治療前相比，治療后患者的IL-2R（P＜0.001）、IL-5（P＝0.001）、TNF-α（P＝0.001）表達水平均顯著降低[25]。另一項關于肝移植患者的研究顯示，環孢素A血藥谷、峰濃度與NFAT殘留基因表達呈負相關（P＜0.000 1）；發生與未發生感染的患者環孢素A血藥谷、峰濃度差異并無統計學意義；在發生腎毒性的患者中也沒有觀察到環孢素A血藥谷、峰濃度明顯升高[26]。這都進一步說明了環孢素A血藥濃度與臨床預后之間存在不一致性。一項關于肝移植的研究測定了NFAT-RGE、IL-2、INF-γ以及GM-CSF，并觀察了患者T細胞介導的急性排斥反應（T cell-mediated acute rejection，TCMAR）和巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染的發生情況。結果顯示，NFAT-RGE等4個指標在發生TCMAR患者中的表達均明顯高于未發生TCMAR患者，而在發生CMV感染患者中的表達明顯低于未發生CMV感染患者；發生TCMAR與未發生TCMAR患者的環孢素A血藥濃度差異均無統計學意義[27]。該研究結果也佐證了CMV感染的發生與環孢素A全血濃度無相關性。目前環孢素A在臨床應用中一般根據患者的血藥濃度或疾病狀態調整給藥劑量。一項關于腎移植患者用藥調整的研究比較了以NFAT-RGE（試驗組，n＝28）和以環孢素A血藥谷濃度（對照組，n＝27）調整給藥方案的治療效果，結果顯示，對照組中有4名患者發生感染，試驗組無感染發生，且對照組中有6名患者發生代謝紊亂，2名患者發生心血管不良反應；試驗組患者的環孢素A用藥劑量以及血藥谷、峰濃度均低于對照組。該研究結果說明，根據NFAT-RGE調整環孢素A劑量可以在保證藥物有效的前提下，最大程度減輕藥物的毒副反應[28]。此外還有研究表明，長期穩定腎移植患者NFAT-RGE水平在20%～30%之間的預后較好[29]。

4 環孢素A代謝物濃度與其臨床療效的相關性

環孢素A進入體內，通過細胞色素P450酶系代謝后主要生成AM1、AM9、AM4N等30余種代謝物[30]。有研究提示，環孢素A的腎毒性、心臟毒性以及感染等毒副反應可能與其代謝物有關[31-33]。一篇關于環孢素A代謝物的綜述指出，AM1、AM9、AM19與環孢素A的腎毒性有關，其中AM1與AM9由環孢素A經單羥化反應而得，這種代謝途徑可以增加環孢素A的極性，使其易于排泄，減少毒副作用的發生[31]。環孢素A在腎臟代謝的能力比在肝臟代謝的能力弱，這或許可以解釋其腎毒性。另一項關于腎移植的研究測定了患者的環孢素A全血濃度和AM1、AM9、AM4N、去甲基化代謝物（demethylcarboxylated-CsA，dMC-CsA）、二羥化代謝物（dihydroxylated-CsA，DiH-CsA）以及三羥化代謝物（trihydroxylated-CsA，TriH-CsA）濃度，記錄了治療期間收縮和（或）舒張壓升高、室上性/室性心律失常、心肌梗死等心血管不良事件，以及糖尿病、肥胖、高三酰甘油、高膽固醇等心血管風險因素的發生情況，探究其與環孢素A代謝物濃度的關系[32]。研究結果表明，糖尿病患者中AM4N、AM1、AM9、AM1c、AM1c9、AM19代謝物濃度較低，這可能與糖尿病患者肝臟代謝功能較低有關；而在這些糖尿病患者中AM1濃度的升高與室上性心律失常以及舒張壓升高有關。研究同時發現，較高濃度的AM4N、dMC-CsA、AM1、DiH-CsA、TriH-CsA以及較低濃度的AM9與心血管不良反應有關。另外一項關于肝移植的研究測定了環孢素A及其代謝物的濃度，研究其與患者發生感染的關系[33]。研究結果表明，有病毒感染史的肝移植患者的DiH-CsA/環孢素A、TriH-CsA/環孢素A濃度比值較高，其中有人類皰疹病毒感染史的肝移植患者的dMC-CsA/環孢素A、AM1/環孢素A、DiH-CsA/環孢素A以及TriH-CsA/環孢素A濃度比值更高，有細菌感染史的肝移植患者的AMI/環孢素A濃度比值更高。

5 結語

從文獻研究來看，PBMCs內環孢素A濃度、CN活性和T細胞功能變化以及環孢素A代謝物濃度均具有預示環孢素A臨床療效以及不良反應發生的作用。通過監測這些指標有望優化器官移植患者的給藥方案，減少感染與急性排斥反應等不良反應的發生。而對于自身免疫疾病患者來說，由于其臨床用藥的復雜性，環孢素A通常與激素以及其他免疫功能調節藥物合用，僅根據環孢素A血藥濃度調整給藥劑量可能收效甚微，而同時進行以上指標的監測，更有利于進一步確定臨床療效不佳的原因，從而指導治療方案的調整或環孢素A用藥劑量的調整。

然而，上述這些能夠表征環孢素A臨床療效的指標中，目前除了環孢素A全血藥物濃度外，PBMCs內環孢素A濃度、CN活性和T細胞功能變化以及環孢素A代謝物濃度均尚無常規開展的實驗室檢查項目。單就實驗室檢查方法而言，檢測試劑的可及性、檢測方法的準確性和可重復性等并不是瓶頸。比如T細胞功能（包括IL-2、NFAT、GM-CSF、TNF-α以及INF-γ等細胞因子）的測定已有商品化引物試劑，CN活性測定也有相應試劑盒上市，且對于這些指標大多數都通過聚合酶鏈反應儀、色譜儀以及流式細胞儀等常規儀器進行檢測。但如何將檢測結果與臨床實際用藥效果形成一一量化對應關系，給臨床提供操作性更強的量化指標才是應用這些指標亟待解決的關鍵問題。要解決這一關鍵問題還有賴于更多的臨床研究數據。目前，上述指標中PBMCs內環孢素A濃度測定的研究相對較多，且2020年已有國際專家共識[13]總結了其監測方法的技術要求及詳細步驟，大大提高了其臨床可行性。

綜上所述，PBMCs內環孢素A濃度、CN活性和T細胞功能變化以及環孢素A代謝物濃度對環孢素A的臨床療效以及不良反應均有一定的預示作用，可彌補環孢素A血藥濃度監測的不足，但其臨床實用性還需進一步提高。