食源性病原微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用與研究進(jìn)展

吳青梅

（扶綏縣疾病預(yù)防控制中心，廣西 崇左，532199）

食源性病原微生物的檢測，先進(jìn)行前增菌，再用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，并通過體外人工進(jìn)化程序篩選，可明顯提升檢測的靈敏性及準(zhǔn)確性，這也是目前食源性病原微生物快速檢測技術(shù)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)，目前從自然界微生物中篩選某菌種一般需8～48 h，占用較長的時(shí)間，采用提高靈敏度的措施，在細(xì)菌檢測中只需短時(shí)間增菌，達(dá)到檢測的目的，這是快檢方法發(fā)展的一個(gè)必然趨勢；另外，常規(guī)方法對實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測中不同目標(biāo)微生物增菌，增加工作量和工作難度，檢測效率還不高，快檢技術(shù)需要解決對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定的干擾非優(yōu)勢菌的檢驗(yàn)問題[1]。近年來，靈敏度高且快速的食源性致病菌檢測方法不斷完善，它需要利用生物化學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)行檢測，將朝著高靈敏度、多標(biāo)記、多殘留、高通量方向發(fā)展[2]。

1 食源性病原微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)

1.1 食源性病原微生物快速檢驗(yàn)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)，它是20 世紀(jì)60 年代發(fā)展起來的一種新型體外快診斷方式[3]。膠體金技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡捷等特點(diǎn)，在臨床診斷，環(huán)境污染，食品安全檢測中得到了日益廣泛的應(yīng)用，當(dāng)前這項(xiàng)技術(shù)較少應(yīng)用于微生物檢測中，往往需要計(jì)算檢測的靈敏度、特異性問題，一般靈敏度達(dá)到1×106CFU/mL，5 min 內(nèi)顯示結(jié)果，但是，對于致病性微生物的監(jiān)測有沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌等是不允許檢出的，此方法不能取得實(shí)際成效及推廣應(yīng)用價(jià)值[4]。

目前，有研究將免疫測定技術(shù)與PCR 結(jié)合建立免疫-PCR 免疫膠體金技術(shù)，可獲得較高的檢測靈敏度和特異性。劉志科，楊寧寧，徐明國，等[5]研究中PCR 鑒定用雞白痢沙門氏菌特異性引物進(jìn)行PCR 檢測，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)、鑒定，最終得到了invA 融合蛋白，作為進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測手段，這種標(biāo)記物的制備方法顯著提升現(xiàn)有分析方法的靈敏度及特異性，降低假陽性率；并在此基礎(chǔ)上使生物膠體金銀染技術(shù)迅速發(fā)展起來，設(shè)計(jì)與目標(biāo)微生物沙門菌invA 基因，在經(jīng)醛基化處理的玻片上點(diǎn)加探針，并與提取的靶DNA 或靶探針連接成一條序列與探針特異性序列完全互補(bǔ)，待測核酸雜交靶探針結(jié)合巰基化探針生成復(fù)合結(jié)構(gòu)，利用膠體金能穩(wěn)定而又迅速吸附蛋白法而不改變生物活性的特點(diǎn)通過在膠體金上連接巰基化DNA 或蛋白質(zhì)，銀染放大信號(hào)，對目標(biāo)微生物直接取樣進(jìn)行分析，特異性強(qiáng)、靈敏度高，該技術(shù)可作為DNA 芯片技術(shù)的微生物檢測方法，可以實(shí)現(xiàn)生物樣本的高通量并行檢測[6]。

1.2 食源性病原微生物快速檢驗(yàn)免疫磁珠分離技術(shù)免疫磁珠分離技術(shù)(immunomagnetic beads separation techniques，IMBS)是一種生物親和技術(shù)，將免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性與磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合進(jìn)行分離富集，用于細(xì)胞分離和提純使用，它分離速度快、過程簡單、成本低，完善了傳統(tǒng)的致病性微生物檢測不足，經(jīng)免疫磁珠分離富集后，使吸附平衡的時(shí)間大大縮短，在微生物快檢技術(shù)應(yīng)用中可行性較高，是構(gòu)成微生物快檢技術(shù)開放很重要的一環(huán)[7]。免疫磁珠技術(shù)結(jié)合其他檢測技術(shù)應(yīng)用于食源性病原微生物的檢測，具有很大的應(yīng)用價(jià)值，未來其發(fā)展空間也很廣泛。

在研發(fā)這項(xiàng)技術(shù)方面需要著重探究。納米磁珠質(zhì)量是影響檢測結(jié)果的因素，不易制備，這項(xiàng)技術(shù)的重點(diǎn)在于研發(fā)優(yōu)質(zhì)的納米磁珠。在抗體制備上，將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯(lián)到磁珠微球上將針對特定病原微生物的多抗或單抗偶聯(lián)到磁珠微球體上，把修飾后的磁珠和待檢樣品的增菌液混合，通過抗原抗體反應(yīng)，將目標(biāo)病原體分離出來[8]。因此，這項(xiàng)技術(shù)要應(yīng)用到食源性病原微生物免疫檢測中很重要的一點(diǎn)就是找到致病菌的特異性抗原靶標(biāo)。

但因食品基質(zhì)微生物菌群多樣又復(fù)雜，容易影響抗體，選取的抗原靶標(biāo)不特異，將摻入較多雜菌，雜菌抑制了目標(biāo)菌的生長繁殖，也導(dǎo)致無法正確檢測到目標(biāo)菌，目前適用于不同來源的病原微生物檢測技術(shù)產(chǎn)品通用性較差，對復(fù)雜食品樣品微生物的檢測，靈敏度并不高，不容易穩(wěn)定，因此，找到合適的特異性較高的抗原靶標(biāo)，未來這項(xiàng)技術(shù)將朝向用多種單克隆抗體技術(shù)和其他技術(shù)相聯(lián)合的方向發(fā)展[9]。

1.3 食源性病原微生物快速檢驗(yàn)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorpt ion/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOFMS)對細(xì)菌檢測，其原理是每種微生物都有其自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，細(xì)菌蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合后，利用激光電離將蛋白提取出來，入檢測器后，便被捕獲，結(jié)合各分子量的蛋白質(zhì)經(jīng)過飛行管耗時(shí)從而對樣品進(jìn)行定性和定量分析[10]。樣品預(yù)處理過程應(yīng)簡單易行，菌落直接涂于靶板上，也可以使用甲酸萃取法將蛋白后上靶板給提取出來，獲得高質(zhì)量的分辨率、穿透率高的質(zhì)譜圖，省去了對樣品預(yù)先評估環(huán)節(jié)，操作簡便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，分辨率更高。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)目前在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，該方法相較傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定操作相對煩瑣、費(fèi)時(shí)，其高靈敏度、自動(dòng)化的操作，試驗(yàn)成本較低[11]。

我國常見食源性致病菌的檢測方法成為研究的熱點(diǎn)，構(gòu)建了對應(yīng)的檢測體系，為微生物的快速檢測提供了檢測技術(shù)。而微生物蛋白質(zhì)具有龐大的信息量，細(xì)菌蛋白質(zhì)表達(dá)具有不確定性，不易進(jìn)行微生物的溯源分型，過程中需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行各種處理和歸類，滿足準(zhǔn)確分型的應(yīng)用，目前部分學(xué)者對微生物分型追蹤溯源進(jìn)行研究，往往是完善數(shù)據(jù)，進(jìn)行基礎(chǔ)的研究。另外，研究著重從微生物的培養(yǎng)基、菌體前處理等采用MALDI-TO檢測[12]。

MS 技術(shù)檢測方法研究，獲得了具有普遍適用性，易于推廣檢測的優(yōu)化條件；將樣本菌涂在測試靶板上，進(jìn)行研究，投入成本低，操作方便，獲得可替代的一次性紙靶板，省去繁雜的操作步驟，還能節(jié)省檢測洗靶的時(shí)間；在不采取前處理措施情況下，對血流感染的細(xì)菌快速鑒定[13]。另外，這些技術(shù)同時(shí)聯(lián)合其他技術(shù)，有效拓寬了檢測適用范圍。

基于細(xì)菌表面蛋白分子量檢測的MALDI-TOF-MS 技術(shù)現(xiàn)階段尚且未形成對應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，但由于其高準(zhǔn)確性、快速周轉(zhuǎn)時(shí)間和低成本等優(yōu)點(diǎn)，使得該技術(shù)在全球微生物實(shí)驗(yàn)室被廣泛采用。而部分菌屬的蛋白質(zhì)水平不顯著，不利鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，若對單增李斯特氏菌和蠟樣芽胞桿進(jìn)行檢測，不易獲得準(zhǔn)確檢驗(yàn)結(jié)果，需要采用二級(jí)質(zhì)譜鑒定方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的細(xì)分，當(dāng)然需要更加優(yōu)良的分析系統(tǒng)和軟件支撐。另外，對于各種常見食源性致病菌鑒定和分型方面，仍需要對數(shù)據(jù)庫和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫都進(jìn)一步擴(kuò)展和完善。

2 總結(jié)與展望

微生物快速檢測方法無法檢測病毒等方面，其局限性日益顯現(xiàn)，需要增菌培養(yǎng)、檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，因此，不如真菌毒素、違禁食品添加劑等化學(xué)性有害物的快速檢測方法應(yīng)用范圍廣。但近年來，多學(xué)科交叉的應(yīng)用、食品檢驗(yàn)體量越來越大，使食源性病原微生物快速檢測技術(shù)獲得了很大的進(jìn)展。通過對生產(chǎn)技術(shù)在原有基礎(chǔ)上的局部改進(jìn)和創(chuàng)新，使檢驗(yàn)效率和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性得到了極大提高，并對解決部分專業(yè)局限的可行方案進(jìn)行了優(yōu)化，使快速檢測技術(shù)發(fā)展十分迅速，比如應(yīng)用分子生物學(xué)方法不斷完善，這些技術(shù)還存在著薄弱環(huán)節(jié)，需逐步研究改進(jìn)和拓展，而將引領(lǐng)食源性病原微生物的快速檢測工作的前行。