一個鋅指結(jié)合蛋白編碼基因調(diào)控水稻種子萌發(fā)

周 煉，陳洛，吳偉，楊梯豐，張少紅，趙均良

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/ 廣東省水稻育種新技術(shù)重點實驗室/ 廣東省水稻工程實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南優(yōu)質(zhì)稻遺傳育種重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】全球有超過50%人口以水稻為主糧，水稻是我國種植面積最大、總產(chǎn)量最多的糧食作物。水稻生產(chǎn)在我國糧食生產(chǎn)中占有極其重要的地位，對我國糧食安全具有舉足輕重的作用。然而，隨著農(nóng)村主要勞動力向城市轉(zhuǎn)移，農(nóng)村勞動力短缺已成為水稻生產(chǎn)中的突出問題。采取輕簡化、機(jī)械化的生產(chǎn)方式，是解決這一問題的根本出路。水稻直播是將預(yù)萌發(fā)過的種子直接撒播到田里進(jìn)行生產(chǎn)，具有節(jié)本、省工、高效等優(yōu)勢，深受農(nóng)民青睞［1-2］。近年來水稻直播在全國快速發(fā)展，有助于緩解農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中勞動力短缺的問題。尤其是雙季稻區(qū)，雙季直播稻不僅灌溉用水減少，而且生育期縮短，有助于緩解兩造之間銜接緊張的問題。水稻直播有濕直播、半濕直播和旱直播3 種主要方式。無論哪種方式，都面臨適宜直播使用的水稻品種缺乏這個共同難題。其主要原因是由于當(dāng)前使用的直播稻品種多是從傳統(tǒng)移栽品種中篩選而來，而直播所需要的耐淹水、耐低溫萌發(fā)、早生快發(fā)、抗倒伏等能力往往不是傳統(tǒng)移栽品種選育的主要目標(biāo)，因此這些品種大多缺乏直播所需的關(guān)鍵性狀，不能很好地發(fā)揮品種的產(chǎn)量優(yōu)勢。另外，我國大部分稻作區(qū)在早稻或一季稻的播種期都會遭遇“倒春寒”或“寒露風(fēng)”等15℃以下的低溫天氣影響，本研究團(tuán)隊前期研究也發(fā)現(xiàn)廣東主推優(yōu)良品種中超過90%的品種低溫萌發(fā)力在10%～50%。因而，鑒定調(diào)控水稻直播關(guān)鍵性狀的功能基因，解析其分子調(diào)控機(jī)制，運用分子輔助技術(shù)選育適合直播的品種，是解決目前水稻直播難題最有效的方法之一，對于直播稻的深入推廣和應(yīng)用具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】隨著水稻直播面積的擴(kuò)大，育成品種低溫萌發(fā)力低下、無法滿足直播需要的矛盾愈發(fā)凸顯，關(guān)于水稻耐低溫萌發(fā)的分子遺傳研究逐漸成為熱點。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外多個團(tuán)隊利用“雙親”遺傳材料，如DH 群體［3-5］、重組自交系/回交系［6-14］、雜交F2:3群體［15-16］、染色體片段代換系［17-18］等，和自然品種［19-23］開展了水稻低溫萌發(fā)力QTL 的定位。據(jù)統(tǒng)計，迄今共鑒定出超過40 個低溫萌發(fā)力QTL 位點，廣泛分布于水稻的12 條染色體，但只有位于第3 染色體的qLTG3-1［7］、位于第7 染色體的OsSAP16［23］和來自野生稻的LTG5［24］被成功克隆和確認(rèn)功能。qLTG3-1是第一個被克隆的水稻低溫萌發(fā)力基因，對耐低溫萌發(fā)的貢獻(xiàn)率達(dá)35.0%。qLTG-3-1 是一個富含甘氨酸（GRP）的未知功能蛋白，根據(jù)其氨基酸序列、時空表達(dá)模式的分析以及組織切片結(jié)果，推測其可能作用于促進(jìn)種胚外層包裹組織的液泡化降解，從而增強種子的低溫萌發(fā)力［7］。OsSAP16 是水稻18 個SAP 成員之一，擁有保守的A20/AN1-C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)域，不同品種中OsSAP16等位基因的功能差異可能來自于表達(dá)水平，提高或降低OsSAP16表達(dá)量，相應(yīng)地能夠增強或降低水稻低溫萌發(fā)力，但其調(diào)控水稻低溫萌發(fā)的分子機(jī)理仍然未知［23］。LTG5來自普通野生稻Y12-4，編碼一個葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，超表達(dá)LTG5基因可以顯著地提高種子的低溫萌發(fā)率［24］，但其分子機(jī)制尚不清楚。

【本研究切入點】基因的表達(dá)情況往往與其功能高度相關(guān)。隨著組學(xué)測序的興起，利用多組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合能夠快速地鎖定QTL 定位區(qū)間的候選基因。Mao 等［25］、Yang 等［26］利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）和轉(zhuǎn)錄組測序相結(jié)合，將QTL 位點的候選基因縮小到兩個基因。Yang 等［27］在GWAS 的基礎(chǔ)上結(jié)合單倍體型分析和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，快速地將候選基因鎖定到兩個基因的范圍。本研究以已獲得的水稻低溫萌發(fā)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為切入點，深入分析、挖掘新的水稻低溫萌發(fā)調(diào)控基因及其分子作用機(jī)理，篩選到一個差異表達(dá)基因OsYIPL1，通過構(gòu)建OsYIPL1過表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化材料，結(jié)合其萌發(fā)相關(guān)表型，探究OsYIPL1在調(diào)控水稻低溫萌發(fā)中的功能。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬克隆新的水稻低溫萌發(fā)力相關(guān)基因，進(jìn)一步解析其分子調(diào)控機(jī)理，為水稻低溫萌發(fā)品種改良和分子育種提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 日本晴（Nip）由本實驗室自行繁殖和保存。遺傳轉(zhuǎn)化所用的受體親本日本晴由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司提供。萌發(fā)試驗所用的野生型及轉(zhuǎn)基因材料于2021 年早季種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南區(qū)試驗基地，3 月4 日播種，4 月8 日移栽，每個株系種植2 行，每行8 株，株行距為19.8 cm×19.8 cm，采用常規(guī)栽培和水肥管理。種子于7 月上旬收獲，曬干后室溫存儲3 個月，用于常溫和低溫萌發(fā)力評價。

1.1.2 供試載體及樣品 pOX 載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實驗室改造及保存，是在pCAMBIA1300 骨架上將35S 啟動子替換為水稻Ubiquitin 啟動子。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析流程詳情見Yang 等［26］驗證所用RNA 樣品為轉(zhuǎn)錄組測序備份樣品。R1、R2 為高LTG 品種，S1、S2 為低LTG 品種。T0、T1、T2 和T3 分別為低溫萌發(fā)0、48、96、144 h 等處理階段。

1.2 試驗方法

1.2.1 萌發(fā)試驗 每個水稻品系取300 粒飽滿的種子置于49 ℃恒溫箱處理96 h 以打破休眠。常溫浸種24 h，蒸餾水沖洗3～5 次，每50 粒種子均勻放置于鋪有濾紙的9.0 cm 培養(yǎng)皿中，加5 mL蒸餾水，分別置于28 ℃和13 ℃人工氣候箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗，每個處理3 次重復(fù)。以芽長≥2 mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，28 ℃每天統(tǒng)計種子的萌發(fā)勢，共統(tǒng)計5 d；13 ℃每隔一天統(tǒng)計種子的低溫萌發(fā)勢，連續(xù)觀察10 d。以萌發(fā)勢作為衡量種子萌發(fā)能力的指標(biāo)。

1.2.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR 檢測 根據(jù)試驗設(shè)計分別選取新鮮的種胚、葉片等材料，迅速投入液氮凍存，經(jīng)機(jī)械研磨成細(xì)粉狀，按照植物總RNA 小提試劑盒B（Magen，R4151-02B）的操作流程獲得各組織的總RNA。用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，RR047A）合成cDNA。設(shè)計OsYIPL1特異的定量引物（Q-F，GCCTACCTCTTCGACCACG；Q-R，CCGTATGCAGTCCGGTCATC），使用MagicSYBR Mixture（康為世紀(jì)，CW3008）試劑和CFX96PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序為：95 ℃3 min；95 ℃10 s，57 ℃20 s，72 ℃20 s，讀板，共40 個循環(huán)；以O(shè)sUBI作為內(nèi)參（Ubi-QF，ACCACTTCGACCGCCACTACT；Ubi-QR，ACGCCTAAGCCTGCTGGTT），對CT 值進(jìn)行計算分析，獲得檢測樣品中OsYIPL1的相對表達(dá)情況。

1.2.3 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 以日本晴種胚cDNA 為模板，用引物pOX-F（acttctgcagggtacA TGGGGCTGCTGTTCGTG）和pOX-R（aacgcgtact agtaagctTCACCGGGCTTCTTTCCAC）（劃線序列為pOX 載體序列）擴(kuò)增OsYIPL1的CDS 全長。pOX 載體用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后回收，與OsYIPL1擴(kuò)增產(chǎn)物用ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit（諾唯贊，C112-01）通過同源重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B 感受態(tài)，涂布于LB/Kan 平板。陽性克隆經(jīng)測序鑒定后，提取質(zhì)粒。正確的pOX-YIPL1 質(zhì)粒寄送到武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司，委托其進(jìn)行后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 取轉(zhuǎn)基因苗和對照日本晴的葉片，分別提取gDNA 和總RNA。用潮霉素特異引物Hpt-F（ATTTGTGTACGCCCGACAGT）和Hpt-R（GTGCTTGACATTGGGGAGTT），以轉(zhuǎn)基因植株gDNA 為模板，檢測轉(zhuǎn)化載體的存在。總RNA按照1.2.2的方法，檢測OsYIPL1的表達(dá)量，篩選真正的過表達(dá)株系。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsYIPL1 是水稻低溫萌發(fā)差異表達(dá)基因

在Yang 等［26］研究基礎(chǔ)上，利用已獲得的不同水稻品種、低溫萌發(fā)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選到另一個差異表達(dá)基因LOC_Os10g22410。其基因注釋是與果蠅Yippee 基因［28］同源的鋅指結(jié)合蛋白編碼基因，本研究將其命名為OsYIPL1（Yippeelike 1）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示（圖1A），在種子萌發(fā)中后期，高LTG 品種（R1、R2）中OsYIPL1的表達(dá)量顯著高于低LTG 品種（S1、S2），尤其是低溫萌發(fā)96 h 后的T2 階段，差異達(dá)到2.1倍。實時熒光定量RT-PCR 的結(jié)果（圖1B）同轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，低溫萌發(fā)96 h 后高LTG品種中OsYIPL1的表達(dá)量平均是低LTG 品種的3.1倍，證明OsYIPL1確實在高LTG 品種的低溫萌發(fā)過程中表達(dá)更高。

2.2 OsYIPL1 的時空表達(dá)模式

為研究OsYIPL1的生物學(xué)功能，首先探索其在不同水稻組織中的時空表達(dá)模式。以日本晴的葉片、葉鞘、莖、枝梗、穎殼、小穗（穎花）、花藥和幼胚（授粉后7 d）為組織材料，水稻OsUBI基因為內(nèi)參，OsYIPL1的CDS 序列148～226 區(qū)段的特異擴(kuò)增片段（引物Q-F/R）為目標(biāo)，檢測其相對表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖2），OsYIPL1在葉片中的表達(dá)量最低，其次是葉鞘、莖和枝梗，在生殖器官小穗、花藥、幼胚中的表達(dá)量較高。其中在小穗、花藥和幼胚中表達(dá)量分別是其在葉片的35、265 和17 倍。

2.3 OsYIPL1 超表達(dá)株系的檢測

以日本晴為受體材料，利用pOX 載體過量表達(dá)OsYIPL1，T0代共獲得6 株轉(zhuǎn)化陽性植株。通過定量檢測，其中有兩株OX-1 和OX-2 中OsYIPL1的表達(dá)量是對照野生型的44.5 和89.8 倍（圖3）。OX-1 和OX-2 便作為OsYIPL1超表達(dá)株系，用于后續(xù)試驗。

2.4 OsYIPL1 調(diào)控水稻種子萌發(fā)

為進(jìn)一步研究OsYIPL1超表達(dá)對于水稻種子萌發(fā)的影響，以同時收獲的日本晴野生型和OX-1、OX-2 轉(zhuǎn)基因T2代成熟種子為材料，進(jìn)行常溫（28℃）和低溫（13℃）萌發(fā)試驗。結(jié)果表明，在常溫下（圖4A、B）OX-1 比野生型萌發(fā)快，且每日的萌發(fā)率都高于對照：處理后1 d 比對照提高24.9%，處理后2 d 提高12.8%，處理后3 d 提高16.9%，處理后4 d 提高20.0%，處理后5 d 提高17.2%，平均比對照提高18.3%；而OX-2 則相反，處理后5 d，仍然只有39.2%的種子萌發(fā)，萌發(fā)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照：處理后1 d 下降100%，處理后2 d 下降28.2%，處理后3 d 下降49.5%，處理后4 d 下降47.2%，處理后5 d 下降47.8%，平均下降54.54%。在低溫下（圖4C、D），OX-1 和OX-2 的萌發(fā)率都低于對照，且OX-2降低得更多，OX-1 的低溫萌發(fā)率比對照平均下降43.8%，OX-2 比對照平均下降81.5%。表明適當(dāng)提高OsYIPL1的表達(dá)水平（如OX-1），可以促進(jìn)常溫下水稻種子萌發(fā)，過高則抑制（如OX-2）；過表達(dá)OsYIPL1會抑制低溫下水稻種子萌發(fā)，且這種抑制隨OsYIPL1表達(dá)量的升高而增強。

3 討論

3.1 提高直播稻成苗率的方法

“出苗、防草、抗倒”是水稻直播適應(yīng)性的3 個重要方面［29］。為提高直播稻的成苗率，尤其是低溫、低氧條件下的萌發(fā)率，常用的措施有種子播前處理和種子包衣。研究表明，種子播前用50 mol/L 亞硒酸鈉或100 mg/L 水楊酸處理，可以促進(jìn)種子淀粉代謝和提前萌發(fā)。種子包衣通常包含殺蟲劑、營養(yǎng)物質(zhì)等，有助于種子萌發(fā)和幼苗生長，降低病蟲害［30］。除撒播外，條播、穴播等直播方式也應(yīng)用于實際生產(chǎn)，以降低鼠鳥害、成苗率低、倒伏等造成的損失［31］，但這兩種方式都增加了水稻生產(chǎn)的成本。也有研究也致力于從優(yōu)良的育成品種中篩選早生快發(fā)、耐淹水萌發(fā)的水稻品種，以應(yīng)用于水稻直播，是否適用于大面積生產(chǎn)效果還未知［32］。因而，鑒定和克隆水稻低溫、耐淹萌發(fā)力相關(guān)基因并開展分子育種，培育耐低溫、淹水萌發(fā)的直播稻品種，才是最經(jīng)濟(jì)、高效的方式。

3.2 OsYIPL1 調(diào)控水稻種子萌發(fā)的機(jī)制分析

文獻(xiàn)資料顯示，動物中Yippee 類似（YPEL）蛋白家族是一個高度保守的鋅指結(jié)合蛋白家族，由兩對半胱氨酸及其間的52 個氨基酸組成金屬（鋅）結(jié)合口袋［28］。OsYIPL1 中的Yippee 結(jié)構(gòu)域也是完全一樣的結(jié)構(gòu)。另外，生物信息學(xué)分析表明，幾乎在所有的真核生物中都存在Yippee 同源基因，說明Yippee 類似蛋白可能在維持生命活動中發(fā)揮重要且保守的作用。人類基因組中存在5 個YPEL 家族基因，可能參與細(xì)胞循環(huán)、衰老和腫瘤發(fā)展。其中YPEL1、YPEL2 和YPEL5 的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌病患的存活率呈正相關(guān)：表達(dá)越高，存活時間越長［33］。擬南芥中存在7 個Yippee 同源基因，關(guān)于其基因功能的研究甚少，僅有的數(shù)據(jù)表明，它們在擬南芥響應(yīng)雙生病毒感染、鹽脅迫、花粉萌發(fā)和花粉管伸長、種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中呈現(xiàn)差異表達(dá)［34-37］。

水稻萌發(fā)包括種子吸水膨脹、大分子物質(zhì)合成和細(xì)胞增殖直至胚芽鞘突破種皮等幾個階段，種子外部表皮細(xì)胞變薄、酶解，內(nèi)部胚由脫水、靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入代謝旺盛并不斷生長的狀態(tài)。本研究通過轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，鑒定到一個全新的與水稻低溫萌發(fā)相關(guān)的功能基因OsYIP1。OsYIP1在耐低溫發(fā)芽和不耐低溫發(fā)芽的材料中有明顯差異表達(dá)，同時其在水稻生殖器官中有高表達(dá)。進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因試驗表明，適度提高OsYIP1的表達(dá)量，可以提高水稻的常溫發(fā)芽能力。因此，推測OsYIPL1可能是一個新的調(diào)控水稻萌發(fā)的功能基因。OsYIP1 作為一個鋅指結(jié)合蛋白，可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胚根和胚芽鞘的不斷伸長和生長。另一方面，OsYIPL1 可能也參與非生物脅迫如低溫等的響應(yīng)，抑制生命活動的發(fā)生。因而在水稻低溫萌發(fā)過程中其作用可能是雙重的，需要更進(jìn)一步的研究數(shù)據(jù)來解析。

3.3 OsYIPL1 在水稻遺傳改良中的應(yīng)用前景

關(guān)于水稻低溫萌發(fā)的應(yīng)用研究，主要集中于qLTG3-1的品種改良和標(biāo)記輔助育種。Iwata 等［38］將來自Kasalath 的qLTG3-1［7］和qLTG11［39］導(dǎo)入3 個粳稻品種，發(fā)現(xiàn)qLTG3-1在這3 個品種的遺傳背景下均發(fā)揮功效，但其在秈稻背景的效應(yīng)還未知。Fujino 研究團(tuán)隊以來自Italica Livorno 的qLTG3-1作為功能型等位基因，對來自19 個國家的62 份亞洲栽培稻品種進(jìn)行了等位基因序列分析［7］。楊梯豐等［41］根據(jù)序列分析結(jié)果設(shè)計了分子標(biāo)記，應(yīng)用于水稻低溫萌發(fā)分子輔助育種。

水稻中存在5 個Yippee 同源基因，其中4 個是Os07g0584000、Os11g0551800、Os12g0484700和Os03g0698500。它們之間的功能可能存在冗余、分化或者拮抗。本研究結(jié)果表明，適度地增加OsYIPL1的表達(dá)可以促進(jìn)水稻種子在常溫下的萌發(fā)速度；而在低溫等惡劣條件下，過高表達(dá)OsYIPL1反而抑制種子萌發(fā)，一方面可能是種子觸發(fā)自身的保護(hù)機(jī)制，另一方面則可能是同源基因之間的反饋抑制調(diào)節(jié)。因而，需要系統(tǒng)地研究水稻中YIPL 家族的所有成員的功能，厘清分子調(diào)控機(jī)制，才可以精準(zhǔn)地將其應(yīng)用于調(diào)控水稻低溫萌發(fā)。

4 結(jié)論

低溫萌發(fā)是一個復(fù)雜的生物過程，由微效多基因控制，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和轉(zhuǎn)錄組測序等手段可以有效挖掘相關(guān)調(diào)控基因。低溫萌發(fā)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析表明，OsYIPL1在不同低溫萌發(fā)力品種中呈現(xiàn)差異表達(dá)，尤其是低溫萌發(fā)96 h后，高LTG 品種中OsYIPL1的表達(dá)量是低LTG品種的2 倍以上。OsYIPL1是與果蠅Yippee 同源的鋅指結(jié)合蛋白，其編碼基因特異的在水稻花藥和幼胚中高表達(dá)。在水稻品種日本晴中過表達(dá)OsYIPL1，獲得兩個陽性轉(zhuǎn)基因株系OX-1、OX-28，其中OsYIPL1的表達(dá)量是野生型的44.5和88.9 倍。萌發(fā)試驗表明，在常溫下，OX-1 的萌發(fā)率比野生型平均提高了18.3%；而OX-2 比野生型平均下降了54.5%。在低溫下，OX-1 和OX-2 的萌發(fā)率均比野生型低，平均下降43.8%和81.5%。說明過表達(dá)OsYIPL1可以在一定程度上提高水稻種子在常溫下的萌發(fā)速率，但是過高則抑制；在低溫下，OsYIPL1的過表達(dá)會抑制水稻種子的萌發(fā)，且這種抑制隨OsYIPL1表達(dá)量的升高而增強。由于OsYIPL1相關(guān)的研究幾乎沒有，其分子作用機(jī)理和應(yīng)用研究有待進(jìn)一步開展。