柏參洗劑質量標準研究

陳麗京，高 璟，周偉瓊，劉艷敏

（1.暨南大學附屬順德醫院（順德第二人民醫院），廣東 佛山 528305；2.廣東和翔制藥有限公司，廣東 廣州 510385）

濕氣入侵及身體虛弱易導致婦女身體皮膚尤其是會陰部位出現濕疹、腫脹等癥狀，危害女性健康，引發一系列并發癥。臨床上除口服藥物治療外，也多使用各類中藥洗劑，起到提升預后、降低毒副作用和便于患者自行完成后續輔助治療等目的[1-2]。基于我院實際臨床處方和診療情況，我們根據婦科臨床驗方開發出柏參洗劑用于婦科相關疾病的治療。該制劑由黃柏、苦參、土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥味組成，起祛濕、補氣虛的功效。由于其臨床療效好，患者預后較為理想，為將其開發為現代化院內中藥制劑，有必要對其各藥味尤其是君藥進行鑒別和含量測定研究，以更加科學地控制該制劑的質量[3-5]。

柏參洗劑以黃柏、苦參為君藥，土茯苓為臣藥，其余藥味作為佐使藥。其中，黃柏、苦參含有多種生物堿，文獻報道具有殺菌消毒、增強免疫力、抗感染等藥理活性[6-7]。同時，中醫藥治療皮膚、婦科疾病的臨床和藥理研究表明，黃柏-苦參可作為藥對，與其他藥味組方治療相關疾病，研究經驗豐富，開發相關制劑具有較強的科學性、適應性和可行性[8]。

鑒于此，本研究擬參考藥典標準及醫院制劑研發相關規范、文獻，對柏參洗劑進行薄層色譜鑒別和高效液相色譜含量測定研究，科學、全面、規范地評價該制劑的質量，為后續的制劑開發提供科學依據和研究經驗。

1 儀器與材料

TLC鑒 別 使 用CAMAG REPROSTAR 3型 薄 層成像系統（瑞士CAMAG公司）和CAMAG TLC SAMPLER 4型自動點樣儀（瑞士CAMAG公司）；樣品和對照品稱量使用METTLER TOLEDO分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；含量測定使用Wa‐ters 2695e高效液相色譜儀，配備PDA檢測器、自動進樣器和柱溫箱（美國Waters公司）?？鄥ⅲㄅ枺?21019-201708）、黃柏（批號：121510-201807）對照藥材，鹽酸黃柏堿對照品（批號：111895-201805）購自中國食品藥品檢定研究院。樣品制備用甲醇、乙醇等試劑為分析純，購自廣州化學試劑廠；含量測定流動相用乙腈、磷酸為色譜純，購自Merck（德國）。黃柏、苦參、土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥材飲片購自廣州至信藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別（1）黃柏的TLC鑒別方法：參考藥典標準并進行適當修改，取柏參洗劑30mL，水浴蒸干后殘渣加入含1%醋酸的甲醇溶液40mL，超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至2mL，得供試品溶液；另取黃柏對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液10μL，對照藥材溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，三氯甲烷-甲醇-水（30:15:4）的下層溶液為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。結果供試品與對照品有相同斑點對應，且陰性對照無干擾。結果表明，本方法能夠成功鑒別柏參洗劑中的黃柏（圖1）。（2）苦參的鑒別方法：取本品30mL，水浴蒸干后，殘渣加濃氨水0.3mL，三氯甲烷25mL，放置過夜，濾過，濾液水浴蒸干，加1mL三氯甲烷復溶，制得供試品溶液。另取苦參對照藥材，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液10μL，對照藥材溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板（2%氫氧化鈉溶液制備）上，以甲苯-丙酮-甲醇（8:3:0.5）為展開劑，展開，展距8cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2:4:2:1）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。結果供試品與對照品有相同斑點對應，且陰性對照無干擾。結果表明，本方法能夠成功鑒別柏參洗劑中的苦參（圖2）。（3）上述方法建立后，對其進行方法學和耐用性考察，在低溫低濕（4℃、RH 25%），低溫高濕（4℃、RH 75%），常溫低濕（25℃、RH 25%）和常溫高濕（25℃、RH 75%）環境下考察方法的穩定性。結果顯示，溫濕度變化對黃柏、苦參的TLC鑒別無明顯影響，表明方法耐用性和適應性良好。

圖1 苦參薄層色譜鑒別結果

圖2 黃柏薄層色譜鑒別結果

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液制備方法 精密稱取黃柏堿對照品約10mg，加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）溶解，制得濃度為每mL含1mg黃柏堿的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備方法 精密吸取柏參洗劑1mL，置于10mL容量瓶中，加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）稀釋并加至刻度。所得溶液濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 含量測定方法 使用LiChrospher C18色譜柱（250×4.6mm，填料粒徑5μm），色譜條件為乙腈-0.1%磷酸水溶液（含2mg/mL的十二烷基磺酸鈉），比例為36:64；流速1.0mL/min，檢測波長284nm，柱溫25℃，進樣量10μL。對照品（50μg.mL）和供試品色譜圖見圖3。

圖3 供試品和對照品（50μg/mL）

2.2.4 含量測定方法學考察

2.2.4.1 線性 精密吸取“2.2.1”項下配制的對照品溶液，加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）稀釋，分別制成每mL含黃柏堿200、100、50、20、10μg的溶液，吸取上述溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，作為縱坐標y，濃度作為橫坐標x，進行線性回歸，得回歸方程為y=25340x-220723（r2=0.9995）。結果表明，方法在10~200μg/mL濃度范圍內線性良好。

2.2.4.2精密度 吸取供試品溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，連續6次，記錄黃柏堿峰面積，計算RSD值。結果得RSD為0.90%，表明方法精密度良好。

2.2.4.3 穩定性 將供試品溶液放置在HPLC的自動進樣器中，放置后分別于0、2、4、6、8、12h使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算含量和含量的RSD值。結果得RSD為1.82%，表明方法所制供試品溶液在12h內穩定性良好。

2.2.4.4 重復性 按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算RSD值。結果得RSD為1.98%，表明方法重復性良好。

2.2.4.5 加樣回收率 精密吸取柏參洗劑0.5mL置于10mL容量瓶中，加入黃柏堿對照品溶液適量（表1），加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）稀釋并加至刻度。所得溶液濾過，取續濾液作為供試品溶液。吸取所得溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算含量，回收率和回收率的RSD值。結果得平均回收率為96.74%，RSD為2.65%，表明方法準確度良好（表1）。

表1 加樣回收率測定結果（n=3）

2.3 樣品測定結果 取10批柏參洗劑，按“2.2.2”項下方法每批樣品平行制備2份供試品溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算含量。結果顯示，10批樣品黃柏堿含量為0.6017~0.8065 mg/mL（表2）。

表2 10批樣品含量測定結果（n=2）

3 討論

柏參洗劑共有6個藥味，其中黃柏、苦參已成功開發出薄層鑒別方法，能夠滿足制定質量標準的需要。為完善研究資料，同時更加全面地了解該制劑的質量信息，我們還參考藥典或文獻方法對土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥味進行了TLC鑒別方法摸索[9-11]。結果顯示，土茯苓、野菊花、紫花地丁經優化后未在供試品中找到與對照藥材相對應的斑點；甘草雖有清晰斑點與對照藥材對應，但陰性對照存在干擾。因此，上述藥味的鑒別方法均不列入本文。

在方中無法檢出土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥味的原因，可能與柏參洗劑的制備方法有關：該制劑為藥材飲片水提制備，由于溶劑極性和工藝條件（溶劑量、提取時間、提取循環等）的限制，部分成分可能無法得到充分提取，或在提取過程中受到破壞。同時，TLC法無法排除一些保留值和斑點相似的成分，因此容易存在陰性干擾。上述因素可能導致方中部分藥味無法檢出，但由于本文所用方法能夠成功檢出黃柏、苦參斑點，參考《醫療機構制劑管理規范》相關規定，列入正文藥味達到或超過全方的1/3，具有較好的代表性，因此可以認為本研究成功建立了柏參洗劑的鑒別方法。

含量測定研究預實驗中，我們曾經將苦參堿和氧化苦參堿列入標準，但由于上述兩種成分在制劑中的峰響應明顯低于黃柏堿，且其與后者洗脫所需流動相條件差異較大，加之分離苦參堿與氧化苦參堿需要更加復雜的梯度條件，故最終僅將黃柏堿列為含量測定指標。在優化色譜條件時，所涉及因素較少，且無需對藥典方法進行修改，提高了研究效率。此外，文獻報道顯示，部分復方中藥多指標含量同時測定研究中對鹽酸小檗堿和黃柏堿進行了同時測定，但主要針對關黃柏，而非本文中柏參洗劑所用的川黃柏；同時，《中國藥典》2020年版黃柏【含量測定】項下規定指標性成分為黃柏堿（關黃柏則為鹽酸小檗堿），基于醫療機構中藥制劑含量測定方法通常選擇盡可能與藥典相關規定一致或接近的原則，本研究最終僅測定黃柏堿。

色譜條件優化方面，由于柏參洗劑所含藥味較多，如前段所述，經反復優化，苦參堿與氧化苦參堿等成分難以實現基線分離，部分條件下還會影響黃柏堿的峰型、分離度。本文所用HPLC條件為藥典中黃柏堿測定的條件，在該條件下，黃柏堿的分離度和峰型較好，但其余化合物重疊、拖尾等情況較為普遍，綜合考慮整體分析效率及研究目標（君藥中藥典規定指標性成分的準確測定），因此決定維持原有色譜條件不變。