干細胞來源的外泌體對骨形成作用的研究進展

李云飛，施潔珺，周 益

（浙江大學醫學院附屬口腔醫院/浙江大學口腔醫學院/浙江省口腔疾病臨床醫學研究中心/浙江省口腔生物醫學研究重點實驗室/浙江大學癌癥研究院,浙江 杭州，310006）

在臨床中，即使是最常見的骨折，缺乏有效充分的骨形成也可能導致不良預后。據研究報道，2%到10%的骨折可能由于骨生長不足而發生骨不連[1]。醫療美容中往往會遇到骨缺損修復、骨軟骨愈合等問題，而臨床修復超過臨界大小的骨缺損仍然是個較大挑戰，面臨著遲愈合或不愈合的風險[2]。同時人口老齡化加劇了這種情況。衰老不僅會由于骨密度降低而導致較高的骨折風險，同時也會降低機體骨形成的能力[3]。因此，如何有效修復骨質缺損、促進骨形成仍然是臨床醫生面臨的主要挑戰。臨床上廣泛使用自體和異體骨移植來促進骨形成。自體骨移植物采用自體松質骨、皮質骨或骨髓抽取物，被認為是治療骨折、延遲愈合、防治骨不連的金標準手段[4]。但是，自體骨移植有著較多并發癥如供骨區域感染、出血，移植部位的感染、骨吸收等[5]。有研究表明約20%–30%的接受自體骨移植的患者移植骨吸收現象明顯，在移植部位出現再次缺損[6]。此外，自體骨移植往往不能為具有較大缺損的患者提供足夠的移植骨量[7]。而同種異體骨移植后，超過30%的患者出現并發癥，包括免疫反應、異體骨骨折，骨不連和感染[8,9]，從而導致骨形成量不足，修復效果不佳。

目前生物材料和細胞療法是促進骨形成的主要研究領域。但是，兩種治療方法都有各自的缺點。生物材料的潛在毒性和免疫原性可能導致嚴重的并發癥，而細胞療法可能導致腫瘤和栓塞的形成[10]。而如今，具有較低安全顧慮和較好促進成骨能力的外泌體，為研究人員提供了一種刺激骨形成的新思路。

1 外泌體的概念

大多數真核細胞都會分泌與細胞間通訊相關的細胞外囊泡。這些高度異質的膜封閉結構可能對鄰近和遠處的細胞都有影響。細胞外囊泡可分為三個類型，分別是凋亡小體，微泡和外泌體[11,12]。

細胞外囊泡根據其大小進行分類，其中直徑約為30-150nm的細胞外囊泡群體被稱為“外泌體”[13,14]。它們能在大多數體液中被提取（例如：血液，乳汁，唾液，精液，尿液），并且幾乎能從所有哺乳動物細胞類型中純化獲得（例如：內皮細胞，神經元細胞，肌肉細胞，干細胞等）[11,15,16]。這些具有生物活性的外泌體含有脂質，蛋白質，以及具有功能活性的核糖核酸（如：mRNA，miRNA）。現有的研究表明，上述這些物質是細胞在多種生物學事件（如：細胞間通訊，蛋白質和核酸的運輸，腫瘤發生，代謝）中起作用的重要介質，它們在不同疾病的診斷和治療中也具有廣泛的應用前景[16,17]。盡管外泌體具體如何參與細胞間通訊尚未有深入研究。但有研究表明，外泌體參與細胞間通訊的機制涉及受體-配體相互作用[18,19]。

2 外泌體的分離和鑒定

為了從各種體液或培養細胞的上清液中分離出外泌體，已經研發了幾種分離技術。這些分離技術利用了外泌體的某些特征，例如其大小，形狀，密度和表面蛋白，以使其純化分離。常被應用的技術包括超速離心，超濾，聚合物沉淀，親和色譜法等[20-23]。

其中超速離心是用于外泌體提取的最廣泛使用的分離技術，被認為是外泌體提取的“金標準”[24]。超速離心根據其大小和密度差異將外泌體與其他組分分離。包括：1、低速旋轉（300–500 RCF）以除去細胞和凋亡碎片;2、高速旋轉（1000–20000 RCF）以消除較大的囊泡;3、超速離心（100000–150000 RCF）分離外泌體。超速離心是一種基本不改變外泌體性質的純物理提取方法，但是這種分離技術存在需要的儀器較為精密復雜、耗時較長、提取量有限等缺點[25,26]。為了提高獲得外泌體純度并減少離心時間，可以在最后一步后進行額外的純化，例如蔗糖梯度離心[27]。

聚合物沉淀是一種有效、可靠，能夠替代耗時較多的超速離心的方法[28]。通過調節外泌體的溶解度和分布，它們可以從體液中沉淀出來。目前，幾種外泌體提取試劑盒（例如ExoQuick試劑盒，總外泌體分離試劑盒等）已被研發，其使用不含水的聚合物（例如聚乙二醇）結合水分子，使溶液中不易溶解外泌體顆粒沉淀從而以較少的時間獲得可觀量的外泌體，能夠做到簡單可靠地提取外泌體[28,29]。

在提取到外泌體之后，需要對其做鑒定，通常可以基于囊泡數量，表面生物標志物，大小，電勢等，通過蛋白質印跡，PCR等手段來鑒定提取的外泌體，同時透射電子顯微鏡（TEM）、掃描電子顯微鏡（SEM）和納米粒子跟蹤分析（NTA）也是外泌體鑒定手段之一[30]。但是當使用TEM和SEM檢測外泌體時，對樣品的脫水可能會導致外泌體的形態變化，是其應用的主要限制[31]。

3 干細胞來源的外泌體在骨形成方面的作用

在過去的幾年中，外泌體在骨組織修復和再生領域受到了廣泛的關注，許多研究表明，與骨相關的細胞，如破骨細胞，成骨細胞，骨細胞和骨髓間充質干細胞，也釋放外泌體[32]。通過將生物活性分子轉移至靶細胞，有利于破骨細胞和成骨細胞的分化。外泌體特別是干細胞來源的外泌體單獨或結合載體使用，可有效恢復或促進生物體骨形成能力[33,34]。

Qin 等人的研究發現骨髓間充質干細胞（BMSCs）來源的外泌體上調成骨細胞中成骨基因ALP，OCN，OPN和RUNX2的表達，促進成骨，并且這可能通過MAPK途徑介導[35]。Zhang等人的研究證明間充質干細胞（MSCs）來源的外泌體通過多方面機制啟動骨缺損的快速修復和再生，該機制協調幾種細胞過程的調節，如遷移，增殖，基質合成，巨噬細胞浸潤和細胞因子的產生等；同時MSC外泌體確實可以在一小時內誘導軟骨細胞中AKT和ERK的快速磷酸[36]。在一些特殊原因導致的骨質缺損情況下，干細胞來源的外泌體也有較好的促進骨形成作用，Liu等人發骨髓間充質干細胞（BMSCs）來源的外泌體可通過攜帶Fas蛋白進入紅斑狼瘡（SLE）模型小鼠的BMSCs中，降低miR-29b的細胞內水平，從而導致Dnmt1介導的Notch1啟動子低甲基化的恢復，進而改善SLE模型小鼠BMMSC功能，促進成骨[37]。而對于骨質疏松引起的骨缺損，（人誘導多能干細胞）hiPSC-MSC來源的外泌體有效地刺激rBMSCs-OVX的增殖和成骨分化，其效果隨著外泌體濃度的增加而增加[38]。Nakao的研究表明，用疾病相關刺激對BMSCs進行適當的預處理可以優化外泌體的含量，從而有效地支持特定疾病的修復[39,40]，如使用TNF-α處理的BMSCs來源外泌體可以更有效抑制骨吸收，促進骨形成[39]。

生物材料與外泌體的結合能夠更好地發揮外泌體的促進骨形成作用，與純磷酸三鈣支架相比，含有人誘導多能干細胞的間充質干細胞（hiPS-MSC）來源的外泌體的磷酸三鈣支架具有更強的成骨作用，其可能通過激活PI3K/ Akt信號通路來增強hBMSCs的增殖、遷移和成骨分化[41]。hiPSC-MSC-Exosβ-TCP支架的應用與卵巢切除大鼠模型中，可增強血管生成和骨生成進而促進了顱骨缺損中的骨再生[38]。也有研究表明，BMP2刺激的巨噬細胞分泌的外泌體可以調節BMSCs的成骨分化，而以鈦納米管作為載體運輸外泌體能夠對BMSCs分化進行時間調節，并可以招募多種細胞因子，誘導有利成骨環境[42]。外泌體不僅對骨缺損有促進成骨作用，對于軟骨修復也有一定的促進作用，外泌體處理的缺陷在12周后顯示軟骨和軟骨下骨已完全恢復，且具有表面規則的透明軟骨，與鄰近軟骨完全結合。相反，在對側PBS處理的缺陷中僅發現纖維修復組織[43]。

有研究表明，在外泌體發揮作用的過程中，其中的RNA成分可能扮演了重要角色[44]。Xu等人發現骨髓間充質干細胞來源的外泌體包含miR-302b，miR-203，miR-218，miR-148a，miR-135b，miR-199b，miR-219，miR-299-5p，可能存在促進成骨的作用[45]。Furuta等的研究表明在骨折愈合期間骨髓干細胞來源的外泌體表達mRNA和miRNA來促進骨愈合；同時外泌體還可能分泌若干基因（miRNA-196A，miRNA-27A和miRNA-206）來增強成骨細胞增殖和分化[46]。此外，除了骨源性的外泌體之外，內皮干細胞來源的外泌體注射至骨缺損部位，相對于對照組可以更有效修復骨缺損、促進骨形成，并且在2-4周的骨重建過程中骨組織質量獲得顯著改善[47]。

4 總結

過去的十年中，從外泌體的構成、來源、功能、機制等多方面展開的各種研究增加了研究人員對外泌體的認知，對于外泌體在骨形成方面的研究也取得了較大進展，干細胞來源的外泌體在一定條件下可以通過多種信號分子和通路途徑促進骨形成，促進骨、軟骨缺損的修復和重建。但是外泌體發揮功能的成分較為復雜，功能不一，具體涉及的通路機制需要進一步研究分析。總的來說，外泌體在骨穩態中的強大功能為解決骨骼退行性變化疾病、促進骨形成提供了新穎的方法，同時也需要進一步的研究闡明相關機制以應用臨床。