豬圓環病毒3型檢測方法及感染現狀概述

祖立闖，李 嬌，謝金文，李 峰，王文秀，4

（1.淄博市動物疫病預防與控制中心，山東 淄博 255000；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；4.山東省院士工作站，山東 濱州 256600）

2015年6月，美國某豬場發生了一起母豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙為主要特征的疫病，Palinski等[1]研究表明該病例的致病原為一種新型豬圓環病毒，命名為豬圓環病毒3型（Porcine circovirus type 3, PCV3），隨后我國研究學者在國內養豬密集地區陸續檢測并分離到PCV3，且進一步研究表明PCV3具有類似PCV2（Porcine circovirus type 2, PCV2）的臨床癥狀和致病性，推斷PCV3將類似PCV2成為危害我國養豬業的又一個免疫抑制性疫病[2-5]。故當前加強PCV3的診斷和流行病學監測，對PCV3的綜合防控和保障我國養殖產業健康發展均具有十分重要的現實意義。鑒于此，筆者就目前我國PCV3各種實驗室診斷技術的最新研究進展和PCV3的感染現狀進行概述，為提高我國PCV3實驗室診斷水平以及改善PCV3綜合防控措施提供參考。

1 PCV3的檢測方法

1.1 PCR方法

PCR方法是當前體外擴增DNA最簡單、快速的分子生物學檢測技術，在基層獸醫實驗室得到了廣泛應用。楊威等[6]和姜玲玲等[7]分別根據PCV3特異性序列設計引物，經PCR反應條件的優化，均建立了PCV3 PCR檢測方法，能夠分別特異性擴增出418 bp和649 bp目的基因片段，能夠擴增的最低模板量分別為1.13×10-3ng/μL和0.143 ng/μL。楊威等[6]和姜玲玲等[7]建立的PCR檢測方法操作簡單、檢測快速，可用于PCV3的快速檢測和流行病學調查。

1.2 套式PCR方法

套式PCR方法由常規PCR方法引申而來，其經過二輪PCR擴增反應，第2輪PCR擴增反應以第1輪PCR擴增產物為模板，大幅增加了檢測的敏感性。張靜等[8]根據PCV3全基因組保守區域設計2對特異性引物，建立PCV3套式PCR檢測方法，該方法僅對PCV3檢測呈陽性，最低檢測限為1.74×10拷貝/μL，與商品化檢測試劑盒的符合率較高，可用于PCV3核酸的低含量檢測。楊永寧等[9]根據PCV3基因序列設計合成了內、外兩對引物，建立PCV3套式PCR檢測方法，該方法檢測PCV2、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）均為陰性，外引物PCR擴增的檢測靈敏度為17 ng DNA，內引物PCR擴增的檢測靈敏度為0.17 ng DNA，可用于臨床病料中PCV3的快速檢測。套式PCR方法所用試驗試劑和操作方法均與常規PCR方法相同，但其由于增加了一輪PCR擴增反應，導致其檢測所需時間有所延長。

1.3 熒光PCR方法

熒光PCR方法是將光譜技術引入到PCR擴增反應，其融匯了常規PCR方法快速、特異性擴增的優點和光譜技術精確定量的優點，克服了常規PCR方法不能定量、需要核酸電泳檢測等缺點，但熒光PCR方法試驗操作技術要求較高、試劑成本較高。楊斌等[10]根據PCV3 Cap基因保守區域設計了特異性引物和探針，建立了PCV3 TaqMan熒光定量PCR檢測方法，該方法的檢測靈敏度可達到11.8拷貝/μL，組內和組間重復試驗的變異系數均小于2%，檢測PCV2、CSFV、PRRSV、PRV均為陰性。駱輝等[11]根據GenBank中PCV3全基因組序列高度保守區域設計了1對特異性引物和探針，通過對反應體系和擴增條件進行優化，建立了能夠特異性檢測PCV3的熒光定量PCR方法，該方法的最低檢出濃度為7.87×10-1拷貝/μL，檢測PCV2、PRV、PPV、PRRSV、豬乙型腦炎病毒（JEV）、TGEV、PEDV均為陰性，組內和組間重復性試驗的變異系數均小于1%。暢通等[12]根據PCV3 ORF2基因的保守序列設計1對特異性引物和TaqMan探針，通過構建標準品質粒來制作熒光定量PCR標準曲線，優化反應條件，建立了檢測PCV3的實時熒光定量PCR方法，該方法可以特異性檢測出PCV3，而檢測PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV、PPV、PRV均為陰性，該方法的檢測靈敏度可以達到10拷貝/μL，批內和批間重復試驗的變異系數均小于2%。熒光PCR方法具有快速、靈敏性高、特異性強、定量準確等優點，可為我國PCV3的早期檢測及流行病學調查提供可靠的技術支持。

1.4 等溫擴增方法

等溫擴增法為一種新型的核酸擴增方法，該方法無需PCR儀等特殊儀器，只需要在常規水浴鍋中即可完成整個擴增反應，具有操作簡單、靈敏度高、肉眼判讀等優點，特別適合在現場和基層部門應用，目前在PCV3的檢測中常用的等溫擴增法主要有環介導等溫擴增（LAMP）方法和重組酶介導等溫擴增（RAA）方法。

1.4.1 LAMP方法 朱小甫等[13]根據PCV3全基因序列設計了4條特異性引物，通過反應成分和反應條件的優化，建立了檢測PCV3的LAMP方法，該方法的檢測極限為10個拷貝/μL質粒模板，檢測PCV2、PRV、PPV、豬大腸桿菌、豬沙門氏菌DNA均為陰性，與常規PCR方法的符合率為97.6%。姜辰龍等[14]根據PCV3 ORF2基因保守序列設計特異性引物，建立了檢測PCV3的LAMP方法，該方法59 ℃恒溫擴增36 min即可出現梯形條帶，最低檢測限為1.0×10-1拷貝/μL，檢測圓環病毒1型（PCV1）、PCV2、PRRSV、PRV、CSFV均為陰性，該方法與PCR方法的符合率為95.6%。相對傳統PCR方法而言，LAMP方法敏感特異、簡便快速，可用于PCV3快速檢測和臨床診斷。

1.4.2 RAA方法 吳江等[15]根據PCV3 Cap基因的保守序列設計多對引物和探針，通過篩選引物和優化試驗條件，建立了一種檢測PCV3的RAA方法，該方法可在39 ℃恒溫條件下20 min內快速完成特異擴增反應，檢測PCV2、CSFV、PRRSV、豬A型塞內卡病毒（SVA）、口蹄疫病毒（FMDV）均為陰性，最低檢出濃度為10-2拷貝/μL，與常規PCR方法的符合率為100%。RAA方法操作簡單、快速靈敏、結果可靠，可用于PCV3的實驗室檢測和現場診斷。

1.5 ELISA（酶聯免疫吸附試驗）方法

ELISA方法具有簡單、快捷、敏感、特異、高通量等優點，特別適合大批量樣品的檢測和大面積的流行病學調查，是當前基層獸醫實驗室使用最廣泛的免疫學檢測技術。目前在PCV3的檢測中常用的ELISA方法主要檢測PCV3抗體的間接ELISA方法和檢測PCV3抗原的雙抗夾心ELISA方法。

1.5.1 間接ELISA方法 葛玉鳳等[16]選擇PCV3 ORF2基因中免疫原性較強的一段序列進行截短表達，以獲得的重組Cap蛋白為包被抗原，通過間接ELISA反應條件的優化，建立PCV3重組Cap蛋白間接ELISA抗體檢測方法，該方法檢測PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PEDV、TGEV陽性血清均為陰性，對PCV3抗體的最低檢出效價可達1∶25 600，批內和批間變異系數分別小于5%和10%。何博等[17]采用PCR方法對PCV3 ORF2基因主要抗原區域進行擴增，并利用原核表達系統進行截短表達，以純化后的重組蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA抗體檢測方法，對PCV3陽性血清的最低檢出效價可達1∶20 480，檢測PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV、TGEV等豬常見疫病陽性血清均為陰性，批內和批間重復性試驗的變異系數均小于5%。謝曉妍等[18]以PCV3衣殼蛋白為包被抗原，通過篩選和優化反應條件，建立一種檢測PCV3抗體的間接ELISA方法，該方法批內和批間變異系數都小于5%。間接ELISA方法操作簡單、檢測快速、通量高，為臨床中PCV3感染的診斷和流行病學調查等提供一種敏感、特異、簡便、快速、高通量的血清學檢測技術。

1.5.2 夾心ELISA方法 于俊楠等[19]利用抗PCV3 Cap蛋白的單克隆抗體，通過篩選最佳包被濃度、最佳包被時間、一抗和二抗最佳濃度，建立了檢測PCV3的夾心ELISA方法，該方法單克隆抗體的最佳包被濃度為10 μg/mL（1∶200），一抗最佳稀釋倍數為1∶4 000稀釋，二抗最佳稀釋倍數為1∶5 000，能夠特異性檢測PCV3，與PCV2等多種病毒不存在交叉反應，批內和批間重復性試驗的變異系數均小于5%。夾心ELISA方法可用于臨床中PCV3的鑒別檢測，特別適合于PCV3的大面積流行病學調查。

1.6 膠體金免疫層析方法

膠體金免疫層析方法是將膠體金標記技術、層析分離技術引入到免疫學反應，具有不需特殊儀器、簡便、快速、結果判斷直觀等優點，在動物疫病快速檢測中顯示出了良好的應用前景。高茵[20]利用原核表達系統獲得大小為42 kDa的PCV3-Cap蛋白，經過Western Blot驗證PCV3-Cap蛋白能與鼠源抗PCV3單克隆抗體進行特異性的結合。將重組PCV3-Cap蛋白固定于檢測線，將雞抗葡萄球菌A蛋白（SPA）抗體固定于質控線，通過對膠體金的最佳標記pH、最佳SPA標記量、膠體金復溶液最佳劃膜濃度進行篩選，組裝檢測PCV3的膠體金試紙條，該試紙條的膠體金最佳標記pH為8.0，最佳SPA標記濃度為2.5 μg/mL，最佳質控線劃線濃度為0.4 mg/mL，該試紙條具有良好的穩定性和特異性，密封干燥保存2個月仍具有良好的靈敏性，臨床隨機檢測結果顯示膠體金免疫層析試紙條與ELISA檢測結果完全一致。膠體金免疫層析方法具有簡便、快速、穩定等優點，特別適合于廣大基層獸醫人員使用，具有巨大的發展潛力和廣闊的應用前景。

2 PCV3的感染現狀

隨著我國養豬產業的快速發展，豬群異地流動加劇，動物疫病的發生與流行率隨之增加，研究學者高度重視動物疫病的流行病學監測，掌握不同地區PCV3的感染情況，可及時準確的因地制定綜合防控措施。何慶等[21]采用PCR方法對2015—2017年湖南省680份豬流產胎兒病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為24.4%。趙晶等[22]采用PCR方法對2018—2020年廣西1 308份豬組織病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為5.58%。劉燕等[23]采用PCR方法對2017—2019年鄭州地區1 175份豬組織病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為14.6%。何世成等[24]采用熒光PCR方法對湖南省14個市州821份臨床病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為33.98%。高詩敏等[25]采用PCR方法對2019年山西省11地市521份豬肺臟組織樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為85.22%。肖興等[26]采用PCR方法對湖南省和京津冀地區523頭斷奶仔豬血清樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為68.75%。雷明霞等[27]采用PCR方法對內江市14個病死畜禽無害化場108份病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為12.9%。師乾凱等[28]采用PCR方法對2017—2018年河北省60個豬場310份臨床病料樣本進行PCV3檢測，PCV3陽性率為16.5%。魏其等[29]采用巢式PCR方法對北疆地區40份豬血液樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為50.0%。李蕊等[30]采用PCR方法對北京市8個區縣56個養殖場1 177份臨床樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為1.0%。曾彩虹等[31]采用PCR方法對云南省12個地市29縣區431份臨床樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為9.98%。郭影成等[32]采用PCR方法對2015—2017年吉林省484份豬血清樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為28.1%。劉東旭等[33]采用PCR方法對吉林部分地區10家規模化豬場704份樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為34.2%，PCV3和PCV2混合感染率為22.7%。王會杰等[34]采用PCR方法對河北省2014—2018年209份病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為34.2%，PCV3和PCV2混合感染率為19.61%。鐘順平等[35]采用PCR方法對云南省勐臘縣86份樣本進行PCV3檢測，PCV3陽性率為17.44%，PCV3和PCV2混合感染率為15.12%。何長生等[36]采用熒光PCR方法對2018年安徽省3個地區12個豬場239份扁桃體樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為14.6%，PCV3和PCV2混合感染陽性率為5.0%。段群棚等[37]采用PCR方法對2017—2019年廣西482個規模豬場917份病豬樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為15.81%，PCV3和PCV2混合感染率為11.72%。李靜等[38]采用PCR方法對新疆6個地區449份豬全血或組織樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為14.5%，PCV3和PCV2混合感染率為15.4%，PCV3和PRRSV混合感染率為16.9%，PCV3、PCV2和PRRSV三重混合感染率為15.4%，PCV3、PCV2、PRV、PRRSV四重混合感染率為1.5%。以上流行病學調查表明，PCV3在我國不同地區均有一定的流行率，但不同地區陽性感染率差異較大，且PCV3和PCV2、PRRSV等致病原的混合感染情況較嚴重，應加強混合感染的防控。

3 結語

近年來，PCV3的流行增加了PCV2綜合防控的難度，鑒于過去PCV2給我國養豬業造成的巨大危害，當前提高PCV3的實驗室檢測能力，掌握不同地區PCV3的感染情況對PCV3的綜合防控至關重要。在PCV3的各種檢測方法中，PCR方法最簡單、最便捷，但其敏感性低于套式PCR方法和熒光PCR方法，且PCR方法需要核酸電泳，造成了溴化乙錠（EB）對環境的污染；套式PCR方法的敏感性提高，但需要二輪PCR擴增反應，檢測時間增加；熒光PCR方法敏感性大幅提高，且不需要核酸電泳，但其檢測所需儀器設備、檢測成本提高；LAMP和RRA等溫擴增方法雖然不需要昂貴儀器設備，但引物設計較難，且檢測過程中容易產生污染，出現假陽性；ELISA和膠體金免疫層析等免疫學方法檢測快速、高通量，但具有一定的滯后性，無法對疫病早期或潛伏感染期進行診斷。在PCV3的感染現狀方面，我國不同地區均存在PCV3的流行，但不同地區陽性感染率差異較大，且存在PCV3和PCV2、PRRSV等致病原的混合感染。總之，PCV3作為近年來新發的一種病毒病，其各種檢測方法均具有自身的優勢和缺點，不同實驗室可根據自身條件選擇自己適合的檢測方法，同時PCV3在我國已經具有一定的流行率，應逐步加強PCV3的綜合防控措施。