CXCL9/10在頭頸鱗狀細胞癌中的表達及其與臨床病理特征、HPV16感染的相關性▲

常曉荊 胡 媛

(1 武漢市第六醫院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北省武漢市 430014； 2 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北省武漢市 430022)

頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)又稱為頭頸癌，好發于鼻腔、鼻竇、嘴唇、口腔、唾液腺及喉部等部位[1]，其預后良好，治愈率高[2]。有研究顯示，頭頸部腫瘤的發生與遺傳、吸煙、病毒感染等多種因素有關，吸煙和飲酒是HNSCC發生的兩大危險因素，且人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16感染也與HNSCC的發生密切相關[3]。趨化因子屬于小分子細胞因子家族蛋白[4]。其中，C-X-C基序趨化因子配體(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL)9/10對T淋巴細胞有趨化作用，可促進T淋巴細胞黏附于內皮細胞，在腫瘤血管形成過程中發揮重要作用[5]。本研究探討CXCL9/10在HNSCC中的表達情況及其與臨床病理特征、HPV16感染的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年3月至2016年3月武漢市第六醫院病理科存檔的60例HNSCC組織標本和30例相應癌旁組織標本(其余30例相應癌旁組織標本不可用，故未納入分析)。納入標準：(1)HNSCC均經病理檢查確診；(2)HNSCC患者的臨床資料完整；(3)HNSCC患者入組前均未接受過放化療等抗癌治療。排除標準：(1)合并其他部位惡性腫瘤者；(2)合并腦部疾病者；(3)復發的HNSCC患者。60例HNSCC患者中，男性40例、女性20例，年齡18～<60歲者35例、60～80歲者25例，有淋巴結轉移者22例、無淋巴結轉移者38例，組織分化程度為：高分化13例、中分化24例、低分化23例；根據2018年美國國立綜合癌癥網絡診治指南與美國癌癥分期聯合委員會第8版TNM分期新標準進行臨床分期[6]，Ⅰ～Ⅱ期共31例，Ⅲ～Ⅳ期共29例。本研究經過武漢市第六醫院醫學倫理委員會審批同意。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10 mRNA表達水平：取適量HNSCC組織和癌旁組織，使用TRIzol試劑(上海杰美基因醫藥科技有限公司，批號：GMS12279)提取總RNA，用反轉錄試劑盒(上海信裕生物科技有限公司，批號：60906-10)將RNA反轉錄為cDNA后進行實時熒光定量PCR擴增。CXCL9上游引物序列為5′-AGGGTCGCTGTTCCTGCATC-3′，下游引物序列為5′-TTCACATCTGCTGAATCTGGGTTTA-3′；CXCL10上游引物序列為5′-CTTTCTGACTCTAAGTGGCATTC-3′，下游引物序列為5′-CACCCTTCTTTTTCATTCTAGCAA-3′；GAPDH(內參)上游引物序列為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物序列為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR反應體系包括cDNA模板2.5 μL、Taq酶0.3 μL、上下游引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq 5 μL、用雙蒸水補充至25 μL。PCR反應條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃，30 s，72 ℃、15 s，共35個反應循環。采用PCR儀(濟南歐萊博技術有限公司，型號：LEIA-X4)自動分析得出循環閾值(Ct值)，通過2-ΔΔCt法計算HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9 mRNA、CXCL10 mRNA相對表達水平。

1.2.2 免疫組化分析及結果判定：取適量HNSCC組織和癌旁組織，經石蠟包埋后用切片機以4 μm的厚度連續切片，隨后用二甲苯對石蠟切片進行脫蠟處理10 min，采用枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，蒸餾水反復沖洗后加入3%過氧化物酶，浸泡30 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，3 min/次；分別加入CXCL9、CXCL10兔抗人單克隆抗體25 μL(英國Abcam公司，批號：ab290643、ab283681；稀釋比例均為1 ∶100)，室溫環境下孵育過夜，PBS沖洗5次，3 min/次；加入30 μL通用型二抗(上海威奧生物科技有限公司，批號：WB6030；稀釋比例為1 ∶500)，室溫環境下孵育30 min，PBS沖洗5次，3 min/次；使用二氨基聯苯胺試劑盒(上海吉至生化科技有限公司，批號：DA1010-10 ml)顯色，PBS反復沖洗后用蘇木素復染3 min，最后脫水處理，二甲苯透明，并用中性樹脂封片。在顯微鏡(上海無陌光學儀器有限公司，型號：WMS-1037)下隨機選取5個高倍視野(×100)進行細胞染色強度評分，其中細胞不染色計0分，細胞著淺黃色計1分，細胞著黃褐色計2分，著淺黃色或黃褐色為陽性細胞。并按陽性細胞所占百分比進行評分，陽性細胞百分比為<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計0、1、2、3、4分。細胞染色強度評分和陽性細胞所占百分比評分的乘積即為總分。總分≥1判定為表達陽性(+)，總分<1分判定為表達陰性(-)；總分≥2分定義為高表達，總分<2分定義為低表達。

1.2.3 單管實時熒光定量PCR檢測HNSCC組織HPV16陽性率：取適量HNSCC組織，提取總RNA與合成cDNA的方法與1.2.1一致。采用HPV16熒光檢測試劑盒(無錫市申瑞生物制品有限公司，批號：20140928)進行HPV16檢測。PCR反應體系(45 μL)包括cDNA模板2 μL、HPV16反應混合液40 μL、Taq DNA聚合酶3 μL。上游引物序列為5′-CCACCCAGAAAGTTACCACA-3′，下游引物序列為5′-TGCAACAAGACATACATCGA-3′。PCR擴增條件為37 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共44個反應循環。采用PCR儀自動分析得出Ct值，Ct值≤37為陽性，Ct值>37為陰性。

1.3 統計學分析 采用SPSS 25.1軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10 mRNA表達水平的比較 HNSCC組織中的CXCL9、CXCL10 mRNA表達水平均高于癌旁組織(均P<0.05)，見表1。

表1 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10 mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.2 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10的陽性表達情況 免疫組化染色結果顯示，CXCL9、CXCL10主要位于細胞質，見圖1。CXCL9、CXCL10在HNSCC組織中的陽性表達率均高于癌旁組織(均P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 免疫組化染色結果(×100)

表2 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10的陽性表達情況[n(%)]

2.3 CXCL9/10表達水平與HNSCC患者臨床病理特征、HPV16感染情況的關系 CXCL9、CXCL10高表達患者中，TNM Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移及HPV16陽性的患者比例均高于CXCL9、CXCL10低表達患者(均P<0.05)。CXCL9、CXCL10表達水平與HNSCC患者的年齡、性別、分化程度均無關(均P>0.05)。見表3。

表3 CXCL9/10表達水平與HNSCC患者臨床病理特征、HPV16感染情況的關系[n(%)]

3 討 論

大多數HNSCC起源于頭頸部黏膜鱗狀上皮細胞，是不同組織學級別的鱗狀細胞癌[7]。據統計，2017年全球約有89萬例新發HNSCC患者，患者總數較1990年增加了1倍以上，且死亡患者總數約有50.7萬例[8]。流行病學調查顯示，2010年美國口腔HPV感染率約為6.9%，其中HPV16感染率約為1%[9]。口腔感染HPV與口咽癌病情的加重密切相關[10]。越來越多的證據表明，HPV感染是導致HNSCC發生的重要原因[11]。HPV感染機體后侵入黏膜組織，感染鱗狀上皮基底層細胞，進而造成兩個關鍵的細胞周期調節因子(細胞周期素依賴激酶和細胞周期素)失活，導致細胞周期檢查點失控、細胞增殖異常及病毒基因組擴增[12]。持續感染HPV的細胞會不受控制地增殖，這容易造成DNA損傷和染色體異常，從而增加致癌風險[13]。

趨化因子是與G蛋白偶聯受體的子集相互作用的小蛋白質[14]，在誘導T淋巴細胞趨化、促進白細胞分化和增殖、引起組織外滲等方面起著關鍵作用[15]。CXCL9、CXCL10均屬于趨化因子CXC亞族，二者表達不僅與腫瘤微環境中的免疫細胞遷移、分化有一定關系，還參與調節腫瘤細胞生長、凋亡，在腫瘤進展中發揮促癌作用[16-17]。例如，宋雪等[16]報告，肝內膽管癌患者血清CXCL9表達水平較健康人高，CXCL9表達異常升高與TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤分化程度密切相關，且CXCL9高水平患者的生存率更低；高建等[17]研究發現，乳腺浸潤性導管癌組織中CXCL10 mRNA的相對表達水平高于乳腺良性組織，CXCL10參與乳腺浸潤性導管癌的進展。還有研究表明，CXCL9/10主要調節免疫細胞遷移、分化和激活，通過募集免疫細胞(如細胞毒性淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞)誘發免疫反應[18]。

本研究結果顯示，HNSCC組織中的CXCL9、CXCL10 mRNA表達水平及陽性表達率均高于癌旁組織(均P<0.05)，提示兩者可能與HNSCC的發生有關，檢測HNSCC患者癌組織中的CXCL9/10表達水平或陽性表達情況有助于診斷HNSCC。本研究結果還顯示，CXCL9、CXCL10高表達患者中TNMⅢ～Ⅳ期、淋巴結轉移及HPV16陽性的患者比例均高于低表達患者(均P<0.05)，說明CXCL9、CXCL10高表達患者的TNM分期晚，可能伴有淋巴結轉移且感染HPV16的風險更高，臨床可通過檢測CXCL9、CXCL10表達水平評估HNSCC患者病情，有利于制訂更合適的治療方案，從而改善HNSCC患者的預后。

綜上所述，CXCL9/10在HNSCC組織中呈高表達，且CXCL9/10高表達患者的TNM分期更晚，可能伴有淋巴結轉移且感染HPV16的風險更高。這兩個指標或可為臨床上診治HNSCC提供了新思路。