高中生物學PCR技術中“引物”相關問題歸類分析

呂愛民 柳 嘯

（湖北省監利市監利中學 湖北荊州 433300）

近幾年高考試題和模擬題中出現了大量與引物有關的試題，而現有高中生物學教材只提及PCR 技術需要引物。為什么需要引物？引物是什么？引物的作用是什么？引物的堿基序列如何設計？PCR 循環時需要多少引物？如何選擇引物和判斷引物的互補鏈？引物與PCR 反應時復性溫度的高低和時間長短有什么關系？這些相關問題在教材中并未提及，需要教師對上述相關問題進行歸類分析。

筆者在基因工程專題的復習過程中構建了以引物為核心的知識網絡圖（圖1），培養學生學科內知識的綜合能力，拓展學生視野，提高學生的科學素養。各個擊破相關知識點，夯實學生的基礎，加深對引物的理解。利用精選的典型試題，強化鞏固知識，提升學生的解題能力。同時從側面為教師的教學提供參考，提升對教學廣度和深度的把控。

圖1 “引物”知識網絡圖

1 引物存在的必要性

1.1 DNA 的復制需要引物 DNA 聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加至已有核酸鏈的游離3′-羥基上，而不能使脫氧核糖核苷酸自身發生聚合，即它需要引物鏈的存在[1]。引物是一小段DNA 或RNA，它能與DNA 母鏈的一段堿基互補配對。細胞內DNA 復制以RNA 作引物，從新合成的岡崎片段上發現含有一短暫存在的小的RNA 片段附著在5′端這一事實，可說明DNA 復制時需要RNA引物，這些引物長5～10 bp，現已知RNA 引物的合成是由一種特殊的RNA 合成酶——引物酶所催化的[2]。PCR 反應以DNA 作引物。

例1（2011年江蘇卷），請回答基因工程方面的有關問題：PCR 反應體系中含有熱穩定DNA 聚合酶，下面的表達式（圖2）不能正確反映DNA 聚合酶的功能，這是因為_____。

圖2 DNA 聚合酶催化的反應的表達式

答案：DNA 聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能將單個脫氧核苷酸連續結合至雙鏈DNA片段的引物鏈上。

1.2 引物的作用 DNA 聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA 鏈。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA 聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA 鏈。不同的引物可結合不同的目的基因并進行擴增。

例2，請回答基因工程方面的有關問題：

1）若用PCR 技術擴增psy基因和crtI基因，需要分別在不同的PCR 擴增儀中加入__種引物，其作用是________。

2）在利用PCR 技術擴增R（抗旱）或r基因過程中，利用___可尋找抗旱基因的位置并進行擴增。

答案：1）2；引物與DNA 模板鏈通過堿基互補配對結合，使DNA 聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，從而延伸DNA 子鏈；2）引物。

例3，為研究水稻D基因的功能，研究者將TDNA 插入到D基因中（圖3），致使該基因失活，失活后的基因記為d。為驗證F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根據D基因、T-DNA 的序列，設計了3 種引物，如圖4所示。

圖3 將T-DNA 插入到D 基因

圖4 3 種引物的堿基序列

隨機選取F2植株若干，提取各植株的總DNA，分別用引物“Ⅰ+Ⅲ”組合及“Ⅱ+Ⅲ”組合進行PCR，檢測是否擴增（完整的T-DNA 過大，不能完成PCR）。

如果引物“Ⅰ+Ⅲ”組及“Ⅱ+Ⅲ”組進行PCR均可完成擴增，則相應植株的基因型為__。

如果_______，則相應植株的基因型為__。

如果_______，則相應植株的基因型為__。

答案：Dd；僅引物“Ⅰ+Ⅲ”組進行PCR 能完成擴增，而“Ⅱ+Ⅲ”組不能完成擴增；dd；僅引物“Ⅱ+Ⅲ”組進行PCR 能完成擴增，而“Ⅰ+Ⅲ”組不能完成擴增；DD。

2 引物的設計

2.1 設計引物的原則 引物是根據目的基因特有的一段已知的核苷酸序列設計合成的，能與目的基因的模板鏈通過堿基互補配對特異性地結合。

設計引物的主要原則為[1]：①引物長度應大于16 個核苷酸，可防止隨機結合；②引物與靶序列間的Tm不應過低；③引物不應有發夾結構，即不能有4 bp 以上的回文序列；④2 個引物間不應有4 bp 以上的互補序列或同源序列，在3′端不應有任何互補的堿基；⑤引物中堿基的分布盡可能均勻，G+C 含量接近50%。

例4，請回答基因工程方面的有關問題：

1）通過PCR 技術可在DNA 分子中專一性擴增出某目的基因，其原因是______。

2）（2011年江蘇卷）請回答基因工程方面的有關問題：設計引物是PCR 技術關鍵步驟之一。某同學設計的2組引物（圖5）都不合理，請分別說明理由。

圖5 設計的2組引物部分堿基序列

①第1 組：_____；②第2 組：_____。

3）科研過程中，可用PCR 技術檢測受體細胞是否成功轉入了目的基因。提取轉染后的細胞的全部DNA 分子，用目的基因的引物擴增。擴增完畢后，檢測發現擴增產物中除目的基因外，還有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有______。

①模板受到污染；②退火溫度過高；③引物太短；④延伸溫度偏低。

答案：1）引物是根據目的基因的一段已知核苷酸序列設計合成的（或引物能與目的基因通過堿基互補配對結合）；2）第1 組：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效；第2 組：引物Ⅰ′自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效；3）①③。

2.2 引物的處理 由于引物延伸從3′端開始，3′端不能進行任何修飾，引物5′端對擴增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴增特異性。引物5′端修飾包括加酶切位點、標記生物素、熒光等[3]。為了使經PCR 擴增的目的基因能與運載體正常結合，需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列。在2種引物的5′端上添加不同的限制酶識別序列，是為了保證目的基因定向插入運載體并可避免目的基因自身環化。

例5（2018年江蘇卷），為生產具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因（1 656 個堿基對），利用基因工程大量制備α-淀粉酶。為了便于擴增的DNA 片段與表達載體連接，需在引物的____端加上限制性酶切位點，且常在2 條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是_________。

答案：5′；使DNA 片段能定向插入表達載體，減少自連。

2.3 引物的特點 綜合2.1 和2.2 可知，引物具有以下幾個特點：①引物能與DNA 模板通過堿基互補配對結合；②2種引物之間不能互補配對；③某一引物不能自身折疊出現局部堿基互補配對；④需要在2 種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列；⑤引物不能太短。

3 PCR 循環時與引物相關的計算

PCR 的原理是DNA 分子的半保留復制，所以要根據DNA 分子的2 條模板鏈設計2 種引物。PCR 循環時需要的引物數量的計算有2種方法。

方法1：第n次循環產生的DNA 數為2n，根據DNA 分子的半保留復制可知，需要的引物數為2n個，從第1 次循環開始，需要引物的個數依次為2 個、22個、23個……2n個，故PCR 過程經過n次循環，需要的引物總個數是2+22+23+……+2n=2n+1-2。

方法2：PCR 經過n次循環產生的DNA 數為2n，一共有2n+1條鏈，其中有2條鏈是DNA 母鏈，不含引物，其他的每1 條鏈均含1 個引物，并且2 種引物的數量相等，故PCR 過程經過n次循環，需要的引物總個數是2n+1-2，需要某一種引物的總個數是（2n+1-2）×1/2=2n-1。2n個DNA 中，一個DNA 由1 條母鏈和第1 種引物延伸的子鏈組成，另一個DNA 由另一條母鏈和第2 種引物延伸的子鏈組成，其他的DNA 均由2 種引物延伸的2 條子鏈組成。

例6，通過PCR 方法獲得某目的基因，首先需要設計______（填“一對”或“一個”）引物，PCR 過程經過4 次循環，第4 次循環時需要的引物的數量是__個，4次循環一共需要的引物的總數量是____個。

答案：一對；16；30。

例7（2011年江蘇卷），請回答基因工程方面的有關問題：利用PCR 技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA 復制類似（圖6）。圖中引物為單鏈DNA 片段，它是子鏈合成延伸的基礎。

圖6 PCR 的原理示意圖

①從理論上推測，第4 輪循環產物中含有引物A 的DNA 片段所占的比例為____。

②在第___輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA 片段。

答案：①15/16；②三。

4 引物的選擇和互補鏈的判斷

DNA 聚合酶只能特異性地復制處于2 個引物之間的DNA 序列，引物5′端的堿基與DNA 母鏈3′端的堿基進行堿基互補配對，可作為DNA 復制的起始點，DNA 子鏈的合成方向是從引物的5′端向3′端延伸?？衫眠@一特點判斷引物及引物的互補鏈。

例8（2016年江蘇卷），為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加四環素，平板上長出的菌落，常用PCR 鑒定，所用的引物組成為圖7中的。

圖7 引物組成圖

答案：引物甲和引物丙。

例9，下圖是為了擴增某目的基因所用引物的分布示意圖（圖8），已知引物組合1 和2、3 和4可擴增相關的目的基因，則引物1、3 與___（填α鏈或β 鏈）形成堿基互補配對關系。

圖8 引物的分布示意圖

答案：β鏈。

5 引物與PCR 反應時復性溫度的高、低和時間長、短的關系

PCR 的每次循環可分為變性（90～95℃）、復性（55～60℃）和延伸（70～75℃）3 步。變性的溫度與目的基因中G+C 含量有關；變性時間的長短與目的基因的長短有關，目的基因越長，變性的時間就越長。復性是讓2 種引物通過堿基互補配對與2 條單鏈DNA 結合，復性的溫度與引物中G+C 含量有關，G-C 堿基對間有3 個氫鍵，A-T 堿基對間只有2 個氫鍵，引物中G+C 含量較高，復性時溫度就較高；復性時間的長短與引物的長短有關，引物越長，復性的時間就越長。延伸的溫度不能太高，以防止新合成的子鏈DNA 與母鏈DNA 解聚為單鏈，延伸的溫度也不能太低，是為了保證Taq 酶的活性；延伸所需要的時間長短與目的基因的長短有關，目的基因越長，延伸所需要的時間就越長。

例10（2008年江蘇卷），將動物致病菌的抗原基因導入馬鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關的圖和表。PCR 過程中退火（復性）溫度必須根據引物的堿基數量和種類設定。表1為根據模板設計的2 對引物序列，圖9為引物對與模板結合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？__________。

表1 引物對序列表

圖9 引物對與模板結合示意圖

答案：引物對B。

例11，請回答PCR 擴增時與退火溫度、延伸溫度與延伸時間有關的問題：

1）（2018年江蘇卷）進行PCR 擴增時，反應的溫度和時間需根據具體情況進行設定，下列選項中___的設定與引物有關，___的設定與擴增片段的長度有關。（填序號）

①變性溫度；②退火溫度；③延伸溫度；④變性時間；⑤退火時間；⑥延伸時間。

2）（2017年江蘇卷）PCR 擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破壞___的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但___的引物需要設定更高的退火溫度。

3）（2017年江蘇卷）如果PCR 反應得不到任何擴增產物，可采取的改進措施有___（填序號）。

①升高退火溫度；②降低退火溫度；③重新設計引物。

4）（2021年湖北省元月聯考）通過PCR 方法獲得eGFP 目的片段，首先需要設計___（填“一對”或“一個”）引物，在體外選擇性擴增eGFP 目的片段。PCR 反應一般由95℃熱變性、55～60℃引物和模板配對、72℃延伸3個步驟，經過多次循環完成。延伸階段選用72℃是綜合考慮了2個因素，這2 個因素是_____和_____。

答案：1）②；⑥；2）引物與模板；GC 含量高；3）②③；4）一對；防止DNA 變性；保證Taq 酶所需溫度條件。

提高能力應以落實基礎知識為前提，上述典型例題圍繞引物的相關知識點以考查基礎知識為首要目標，落實對基本概念的理解，例如，引物應該成對存在、引物5′端與DNA 母鏈3′端堿基互補配對、DNA 子鏈只能從引物的3′端開始延伸等；同時對引物的設計與處理、與引物相關的計算及PCR 反應時復性溫度的高低和時間長短等知識點，又可考查學生的科學思維和運用知識的能力。“PCR 反應得不到任何擴增產物”或“擴增產物中除目的基因外還有其他不同大小片段的非目的基因片段”引導學生關注引物在PCR 技術中的應用并學會解決科學研究中遇到的問題。教師應該在落實基礎知識的同時重視對引物的歸納整理，重視教學提升，鍛煉學生的思維，跳出考題。教師應該重視滲透科學、技術、社會相互關系的教育，通過具體事例幫助學生認識生物學與社會發展的緊密聯系[4]。引導學生關注科學知識在生活、生產技術中的應用，努力將學生培養成創新型的人才。