建立檢測樹鼩葡萄糖轉運蛋白GLUT9 mRNA相對表達水平的實時熒光定量PCR方法?

龍維虎 王陳蕓 李哲麗 葉尤松 施紅進 李 濤 肖 涵 唐東紅??

（1 中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院，醫(yī)學生物學研究所 云南昆明 650118 2 云南中醫(yī)藥大學 云南昆明 650200）

近年來，隨著生活水平的提高，營養(yǎng)物質豐富，食物攝入過量，血清高尿酸呈上升趨勢[1]。我國高尿酸血癥人群數量達1 億多，發(fā)病年齡逐漸縮小。高尿酸血癥人群主要表現為血清尿酸鹽濃度過高，女性血尿酸濃度高于6.0 mg/dL，男性血尿酸濃度高于7.0 mg/dL，臨床診斷為高尿酸血癥[2]。血清尿酸水平的升高會增加痛風、高血壓、心臟病、糖尿病的發(fā)病風險，控制血清高尿酸水平，已成為治療代謝綜合征相關疾病的有效手段[3-7]。體內尿酸的產生及代謝包括肝臟尿酸產生的調節(jié)，腎臟、小腸的重吸收及調節(jié)等復雜過程[8]，通過尿酸轉運蛋白完成腎臟和小腸的尿酸分泌及重吸收，保持著血尿酸的平衡[9]。

葡萄糖轉運蛋白（glucose transporters，GLUT）是將細胞外葡萄糖轉運至細胞內的一個跨膜蛋白家族，參與葡萄糖代謝、免疫反應和炎癥反應。到目前為止，已發(fā)現10 多種參與葡萄糖運輸的蛋白質，分布在不同組織，功能也不完全相同，其中GLUT9 由SLC2A9基因編碼，發(fā)揮著將尿酸轉運到細胞外，維持機體血清尿酸平衡的作用[10]。研究發(fā)現，敲除SLC2A9基因的小鼠表現出尿酸濃度偏高，易發(fā)生腎結石及腎臟纖維炎癥等疾病[11]。遺傳學研究表明，影響尿酸的排泄原因約90%認為是基因多態(tài)性遺傳缺陷使近端腎小管對尿酸鹽重吸收的轉運蛋白GLUT9 功能發(fā)生異常所致[12]，可見GLUT9 對調節(jié)尿酸鹽水平起著重要影響。

樹鼩（Tupaia belangeri chinensis）屬攀鼩目，樹鼩科，云南是野生樹鼩主要分布區(qū)域之一，其具有生殖和發(fā)育周期短、方便飼養(yǎng)、進化程度高等特征，研究證明樹鼩與靈長類動物具有較近的親緣關系[13]。在神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)等方面更適合用于人類的生物學和疾病機理研究[14]，目前與人類代謝疾病相關的機理研究主要有糖代謝、脂代謝、骨質疏松癥等[15]。近年來利用樹鼩作為動物模型開展高尿酸致病機理研究也有報道，肌苷作為合成尿酸的原材料，經過PNP 酶的水解作用后生成尿酸，Tang 等[16-17]和楊旭娟等[18]利用肌苷成功誘導高尿酸血癥獼猴動物模型，以及利用氧嗪酸鉀成功誘導樹鼩的高尿酸血癥。可見，樹鼩也是高尿酸血癥動物模型研究中一種重要的實驗動物。本研究建立了實時熒光定量檢測樹鼩動物葡萄糖轉運蛋白相關轉錄水平變化的方法，旨在為進一步研究高尿酸疾病的發(fā)病機制和藥物治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：普通環(huán)境下（溫度20～25℃，濕度40%～70%）飼養(yǎng)的滇西樹鼩6 只，雌、雄各3 只，體重約120 g，2 周齡左右。由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（滇）K2013-0001。使用許可證號為SYXK（滇）K2013-0001。動物實驗由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物研究所動物實驗倫理委員會審批，批準編號為DWS2017058，實驗程序符合動物實驗倫理委員會的要求，并遵守國際慣例，根據實驗動物使用的3R 原則給予人文關懷。

主要試劑：逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）、RT-PCR 酶GoTaq?GreenMaster Mix 2、實時熒光酶SYBR Premix Ex Taq、DL2000 及DL1000 DNA marker（TaKaRa 公司）、RNA 提取液Tripure（Roche 公司）、別嘌醇（純度≥98%，南京都萊生物）、GelRed 染料（Biotium 公司）、肌苷（Sigma 公司）。

主要儀器：高速離心機（美國Sigma 公司）、高通量組織研磨器（寧波新芝公司）、酶標儀MQX200R（Bio-tek 公司）、ND-1000 超微量核酸測定儀（美國DanoDrop 公司）、CFX 96TMReal-Time System C1000TMThermal Cycler（美國Bio-rad 公司）。

1.2 實驗方法

1）引物設計與合成：引物參照人類、獼猴、小鼠目的基因SLC2A9序列設計引物：人類NM_020041.2和NM_001001290.1，獼猴XM_015137992.1，小鼠NM_001102414.1、NM_001012363.2、NM_001102415.1和 NM_145559.2。內參GAPDH參照獼猴NM_001195426.1 的核苷酸序列，利用引物設計軟件Pimer Express 5.0 分別設計引物。其中SLC2A9上游引物5′-ACAATGAAGCAGGAGCGACA-3′，下游引物5′-ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3′，產物大小210 bp；內參GAPDH，上游引物5′-AGCCCCATCACCATCTTCC-3′，下游引物5′-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′，產物大小121 bp；大連寶生物工程有限公司合成。

2）組織取樣及總RNA 提?。河?.5%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射樹鼩，安樂處死動物，迅速采集新鮮腎臟約100 mg，加入1 mL Tripure，加入適合大小的鋼珠，放入高速組織研磨器中徹底研磨；放入1.5 mL EP 管中靜置5 min，加入氯仿200 μL 充分渦旋，靜置15 min；12 000 r/min 離心25 min 后取450 μL 上清液于EP 管中，加450 μL異丙醇，混勻后靜置10 min 后離心；管內壁稍干后加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，離心棄上清液，加入30 μL DEPC 水溶解，水浴10 min。取總RNA 樣品1 μL，測量濃度后，加入DEPC 水稀釋。

3）RNA 完整性檢測：將上述所提取的總RNA樣品各2 μL，經瓊脂糖凝膠電泳后觀察5S、18S 和28S 條帶，再取1 μL 于ND-1000 超微量核酸測定儀測定RNA 濃度。

4）RNA 逆轉錄：按照逆轉錄試劑盒說明操作，分別加入0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix、2 μL 5×PrimeScript Buffer、0.5 μL Random 6 mers、0.5 μL Oligo dT Primer、1 μL RNA（1 000 ng/μL）、RNase Free dd H2O 5.5 μL，總體積10 μL。程序設置為：37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min 條件下獲得cDNA。

5）建立SLC2A9及GAPDHmRNA 實時熒光定量PCR 反應熔解曲線及標準曲線：以Esidilution梯度稀釋逆轉錄合成的樹鼩cDNA 第1 鏈，分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4倍濃度，以原始cDNA第1 鏈及稀釋后的cDNA 為模板，各做2 個平行樣進行實時熒光定量檢測。目的基因和內參基因反應體系如下：1 μL cDNA 模板，各1 μL 的上、下游引物，9.5 μL 去離子水，12.5 μL Taq II 酶；反應條件：94℃30 s，94℃5 s、60℃30 s，35 個循環(huán)，獲得Ct值，建立SLC2A9及內參GAPDH的相關熔解曲線及標準曲線、斜率及R2值、擴增效率。

6）PCR 產物測序驗證：SLC2A9及GAPDH的PCR 擴增產物分別通過昆明鉑尚生物公司測序，測序所得到的核苷酸序列通過DNAMAN 軟件與NCBI 所報道的人類的SLC2A9mRNA 的核苷酸片段序列（NM_020041.2）及GAPDHmRNA 的核苷酸片段序列（NM_001289745.3）進行同源性比對。

7）肌苷致樹鼩高尿酸血癥動物模型樹鼩腎臟組織中SLC2A9mRNA 相對表達量變化檢測：選取6 只空腹樹鼩，每組2 只分3 組。第1 組腹腔注射300 mg/kg 肌苷（inosine）和30 mg/kg 別嘌醇（allopurinol，ALLO）、第2 組腹腔注射300 mg/kg肌苷、第3 組0.9%的生理鹽水。注射1 h 后安樂處死實驗動物，取腎臟組織100 mg，加入1 mL Tripure 后提取RNA 逆轉錄為cDNA，用cDNA 的第1 條鏈作為模板，每個檢測樣品做復孔。CFX Manager 軟件處理分析結果，得到對應的Ct值，以樣品Ct值，通過軟件分析獲得ΔΔCt值，得到組織中SLC2A9mRNA 表達量變化。

2 結果

2.1 RNA 純度和完整性 樹鼩總RNA 樣品經瓊脂糖凝膠電泳，觀察到3 條帶亮度如圖1所示。說明提取的RNA 沒有發(fā)生降解，經ND-1000 超微量核酸測定儀測定結果顯示A260/A280位于1.8～2.0之間，可用于后續(xù)實驗。

圖1 樹鼩組織總RNA 凝膠電泳

2.2 目的基因SLC2A9和內參GAPDHPCR 產物測序及序列比對 將目的基因及內參基因PCR擴增產物送至昆明鉑尚生物公司測序后，用DNAMAN軟件分別對與NCBI 報道的人類SLC2A9（NM_020041.2）和GAPDH（NM_001289745.3）核苷酸片段序列的同源性進行比對（圖2、圖3），結果顯示樹鼩腎臟組織中擴增出的SLC2A9mRNA 的核苷酸片段序列與人類的同源性為81%，GAPDHmRNA 的核苷酸片段序列與人類的同源性為95.1%。進一步說明擴增出的目的片段為樹鼩的GAPDH的核苷酸片段及SLC2A9mRNA 核苷酸片段。

圖2 樹鼩目的片段SLC2A9核苷酸序列與人類核苷酸序列比對圖

圖3 樹鼩GAPDH 的核苷酸序列與人類核苷酸序列比對圖

2.3 樹鼩腎臟組織SLC2A9和GAPDHmRNA實時熒光定量PCR 熔解曲線和標準曲線 通過進行實時熒光定量PCR 反應，繪制出樹鼩腎臟組織SLC2A9mRNA 和GAPDHmRNA 實時熒光定量PCR 熔解曲線和擴增曲線（圖4），顯示樹鼩SLC2A9mRNA 和GAPDHmRNA 實時熒光定量PCR 反應熔解曲線單峰，特異性好。根據Ct值，CFX Manager 軟件制作出GAPDHmRNA 和SLC2A9mRNA 擴增曲線及標準曲線（圖5），GAPDHmRNA 擴增效率為125.4%，斜率為-2.833，R2=0.997；SLC2A9mRNA 擴增效率達到107.7%，斜率為-3.151，R2=0.996。

圖4 SLC2A9（a）和GAPDH（b）mRNA 實時熒光定量PCR 反應擴增曲線和熔解曲線

圖5 GAPDH（a、b）和SLC2A9（c、d）mRNA 實時熒光定量PCR 反應的擴增曲線及標準曲線

2.4 肌苷所致的高尿酸血癥樹鼩SLC2A9mRNA表達水平的變化 樹鼩被安樂死后，從其新鮮的腎臟組織中提取RNA，經實時熒光定量PCR 檢測，以GAPDH為內參基因，SLC2A9mRNA 相對表達變化如圖6所示。在腎臟組織中，肌苷組相對于對照組的表達顯著上調，肌苷加別嘌醇組相對于對照組表達顯著下調，說明所建立的方法能靈敏地檢測樹鼩高尿酸動物模型SLC2A9mRNA 表達水平的變化。

圖6 樹鼩腎臟組織SLC2A9 mRNA 相對表達變化

3 討論

樹鼩作為一種近年來開發(fā)的實驗動物，NCBI未能檢索到樹鼩SLC2A9mRNA 的核苷酸序列。本實驗通過參考NCBI 數據庫的人、小鼠、獼猴核苷酸序列，設計引物，合適的退火溫度，篩選擴增效果較好的引物。序列比對分析了所獲得的內參GAPDH片段及SLC2A9片段，發(fā)現與人類的核苷酸片段序列同源性高達80%以上，說明所擴增的基因片段分別為內參基因GAPDH核苷酸片段及目的基因SLC2A9核苷酸片段。同時可見SLC2A9及GAPDH實時熒光定量PCR 擴增特異性較好，熔解曲線為單峰，無雜峰。為保證熒光定量技術分析結果的可信度，以10 倍為稀釋因子稀釋不同濃度梯度的cDNA，得到目的基因及內參基因表達的標準曲線。擴增效率分別為107.7%和125.4%，R2分別為0.996 和0.997，達到熒光定量要求[19]。說明本研究所建立的實時熒光定量PCR方法可應用于定量檢測樹鼩葡萄糖轉運蛋白GLUT9 mRNA 轉錄水平。

肌苷，也稱次黃嘌呤核苷，常用于誘導高尿酸動物模型的藥物[20]。本實驗采用腹腔注射300 mg/kg 肌苷構建急性高尿酸樹鼩模型，利用建立的實時熒光定量PCR 方法對高尿酸血癥樹鼩進行SLC2A9mRNA 相對表達量檢測，結果顯示肌苷給藥組相對于其他組別表達量顯著上調，與實驗預期相符。本實驗利用實時熒光定量PCR 方法對樹鼩SLC2A9mRNA 轉錄水平的變化實現定量檢測，穩(wěn)定重復性高、可操作性強等優(yōu)點。雖然樹鼩數量來源有限，但實驗數據和結果仍具有一定的參考性，建立的檢測樹鼩葡萄糖轉運蛋白GLUT9 mRNA 相對表達水平的實時熒光定量方法可應用于高尿酸血癥的發(fā)病機理、新藥研究等方面的研究。