BMI1作為頭頸鱗癌干細胞標志物的研究進展*

黃煬，馬洪，李超，周可

550004 貴陽，貴州醫科大學附屬口腔醫院 口腔頜面外科(黃煬、馬洪、周可)；610041 成都，四川省腫瘤醫院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學醫學院 頭頸腫瘤外科(李超)

頭頸癌是全球第六大最常見的惡性腫瘤，每年約有63萬例新確診病例，超過35萬人死亡，患者5年生存率約為50%[1-2]。頭頸癌中最常見的癌癥類型為頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)，其起源于口腔、鼻腔及咽喉等部位。其中包括口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) 及喉癌(laryngeal cancer，LC)等[3]。癌癥干細胞(cancer stem cells，CSCs)是腫瘤內具有干細胞特性的獨特群體，存在于多種癌癥中，在HNSCC中已發現該干細胞亞群,其具有較高的自我更新能力、分化能力、致瘤能力和放化療抗性[4-5]。頭頸鱗癌干細胞亞群僅是小部分頭頸鱗癌細胞，但它們在腫瘤向人體其他器官的轉移中起著關鍵作用。近年來研究發現B細胞特異莫洛尼鼠白血病病毒整合位點1(B cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI1) 的表達與這些表型相關，在原發腫瘤中BMI1陽性表達的CSCs自我更新和分化能力增強，并可介導頭頸鱗癌 CSCs的侵襲性生長和頸淋巴結轉移[5]。目前，HNSCC主要應用多學科綜合序列治療，包含手術切除、化療和放療的聯合治療方法。由于CSCs耐藥性及輻射耐受的特性，伴隨而來的是疾病的不良預后。明確BMI1作為腫瘤干細胞生物標志物并使之成為治療靶點，對于優化HNSCC的治療策略具有重要意義。本文將對近年來有關BMI1作為生物標志物對頭頸鱗癌CSCs的影響的相關文獻進行復習，并基于國內外最新共識對此作一綜述。

1 BMI1的結構與功能

PcG蛋白-多梳家族蛋白是一類在染色質水平抑制靶基因轉錄的蛋白，包含了多梳抑制復合體(polycomb repressive complex,PRC)1和PRC2兩個核心蛋白復合體，在胚胎發育、細胞記憶、細胞周期、細胞增殖和腫瘤形成等過程中起關鍵作用[6]。作為PRC1中的核心成分，BMI1是一種表觀遺傳調控因子，可通過介導轉錄沉默和組蛋白H2AK119Ub的沉積，促進DNA末端切除，從而影響DNA雙鏈斷裂的同源重組修復進程[7]。BMI1還可通過組蛋白的甲基化修飾過程來控制組織干細胞的細胞周期和自我更新[8]。人類BMI1基因位于10號染色體短臂1區3帶(10p13)，長約10 kb，由10個外顯子和9個內含子組成。該基因編碼3.4 kb的cDNA以及36 KDa的蛋白質，由326個氨基酸組成[8-9]。BMI1蛋白由三個重要區域構成,包括：1)中心部分的螺旋—轉角—螺旋—轉角結構域，此為DNA結合結構域，是影響BMI1轉錄活性的重要核心區域；2)氨基末端保守的指環區域，可促進DNA同源重組修復,與細胞增殖和抑制蛋白表達有關；3)羧基端的PEST樣區域，富含脯氨酸及絲氨酸殘基，與促進細胞內BMI1快速降解相關[7,10-11]。以上特征決定了BMI1作為腫瘤干細胞潛在生物標志物發揮功能的基礎。

2 頭頸鱗癌干細胞與BMI1

BMI1作為一種關鍵的頭頸部腫瘤干細胞調節因子，通過H3-K27蛋白的三甲基化和H2A-K119蛋白的泛素化，與c-Myc蛋白協同抑制Ink4a/Arf位點，負調控下游效應分子p16INK4a、p19Arf和p53等，控制細胞周期阻滯和細胞凋亡[6-7,12]。大量的轉錄和轉錄后調節因子也參與調節BMI1的表達，其中包括N-Myc、八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)、Sp1、堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子1(Twist1)、叉頭蛋白M1、E2家族轉錄因子1和婆羅雙樹樣基因4[9,13-14]。研究表明，癌細胞可通過OCT4誘導分化抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1，ID1)和NF-κB協同觸發BMI1和CD44 mRNA高表達，促進頭頸部CSCs的生成[15]。跨膜蛋白CD44作為頭頸部腫瘤干細胞特性最敏感的生物標志物之一，對于維持腫瘤異質性必不可少[16-17]。Prince等[17]經免疫組織化學分析，發現CD44+HNSCC的CSCs中表達高水平的核BMI1，并呈膜高表達CD44與核高表達BMI1基因的特點分布排列在腫瘤微域中。同時證明了HNSCC的CSCs亞群在小鼠體內有強致瘤性且表現出異質性表達。有證據顯示，在HNSCC中BMI1+CSCs可選擇性地獲得共刺激分子CD80的高表達以抑制CD8+T淋巴細胞的活性，從而逃避免疫及化療藥物的殺傷，而當抑制BMI1后觀察到DNA損傷的特異性標志物pH2A.X在HNSCC中顯著升高，同時誘導了與CD8+T細胞募集相關的趨化因子(MIG、IP-10、I-TAC 和CCL5)的轉錄，促使其向腫瘤病灶區域的募集，殺傷腫瘤細胞[4-5,18]。乳腺癌相關研究表明BMI1、Wnt/β-catenin、Notch、PI3K-AKT-mTOR、和Hedgehog(Hh)等信號通路控制著乳腺癌干細胞在主要區域上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的激活以及腫瘤的發生與生長[19-20]。在NPC細胞中BMI1過表達可誘導EMT，激活NPC上皮細胞株與喉聲門下細胞(human subglottic,HSG)的端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,HTERT ) ，促進口腔上皮的異常增生[12,21-23]。而當敲除BMI1或使用BMI1抑制劑時，可逆轉腫瘤細胞以上生物學進程。隨著研究的深入，越來越多證據指向BMI1對頭頸鱗癌CSCs的發生發展關系密切，在頭頸鱗癌的疾病進程起著重要作用。

2.1 OSCC與BMI1

OSCC是多發于舌、頰、牙齦及唇等部位的口腔惡性腫瘤[1]，該病的主要危險因素與吸煙、飲酒和咀嚼檳郎等行為，以及由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16和HPV18和EB病毒引起的感染密切相關[24]。OSCC中CSCs亞群的存在是其復發及不良預后的重要原因，也是其腫瘤異質性的決定因素，調控正常干細胞分裂的信號通路(BMI1、Notch、Wnt和Hedgehog等)也參與了口腔癌的發生，細胞信號通路發生異常激活后，通路之間的串擾促使CSCs的生長，并調節OSCC細胞的活性[25]。Kalish等[26]通過4-硝基喹啉1-氧化物(4-nitro-quinoline 1-oxide,4-NQO)誘導舌上皮干細胞BMI1異位過表達小鼠口腔癌變模型，發現外源性BMI1的表達改變了正常舌上皮中蛋白質翻譯和氧化還原的穩態，增加了小鼠對OSCC的易感性，加強了BMI1作為人類OSCC治療靶點的證據。Rao等[27]研究發現OSCC樣本中BMI1、OCT4和乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)三種細胞表面標記物均陽性表達的病例生存率較單一BMI1表達病例生存率顯著降低，三者可作為一組有效標志物預測患者的預后，提高OSCC的CSCs亞群識別準確度。有趣的是，BMI1過表達還與口腔癌變過程中的上皮異常增生有關，是口腔黏膜下纖維化[28]、口腔白斑[29]、口腔紅斑[23]、口腔扁平苔蘚[30]患者向OSCC發展的預測指標之一。

2.2 NPC與BMI1

NPC是發生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤，在東南亞地區及我國華南地區高發[31]。其發病解剖位置隱蔽，早期癥狀與良性病變相似，早期確診患者比例不足20%[32]。鼻咽周圍毗鄰腦干等重要器官，且對放射治療高度敏感，因此放療是無遠處轉移NPC患者的重要治療手段[31,33]。NPC患者在接受放療后，由于輻射損傷導致口腔上皮細胞DNA雙鏈斷裂，BMI1被募集到DNA損傷位點以促進輻射損傷后的修復。然而BMI1的持續過表達，伴隨其下游靶基因p16、p14的下調，促進了第二原發口腔鱗癌的發生及進展[34]。Deng等[35]研究發現干細胞標志物CD44高表達的NPC干細胞樣細胞(cancer stem cell-like cells,CSC-LCs) 在抑制BMI1后可顯著提高其放療敏感性，促進CSC-LCs的細胞殺傷作用。經BMI1 shRNA慢病毒載體特異性下調BMI1后細胞周期進程受抑制，然而DNA DSB修復具有強細胞周期依賴性。sh-BMI1 CD44+NPC-CSC-LCs接受放射刺激后 G1期延長,對輻射最敏感的G2/M期阻滯，導致DNA DSB修復率顯著降低,細胞凋亡增加。Xu等[36]通過裸鼠體內成瘤實驗證實了sh-BMI1可削弱CD44+NPC-CSC-LCS的體內致瘤性。BMI1也參與EMT過程，調控癌細胞的遷移與侵襲能力。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和Twist1作為EMT的標志物，一方面Twist1可直接增強BMI1的轉錄。另一方面，在鋅指轉錄因子的介導下，BMI1能與E-cadherin啟動子結合，抑制E-cadherin的表達同時上調纖維連接蛋白及波形蛋白,進而導致鼻咽上皮細胞遷移及侵襲力增強[12]。此外，BMI1還可與抑癌基因PTEN位點結合，下調PTEN的表達后激活PI3K-Akt通路，促使NPC復發[37]。由此可推測BMI1是激活PI3K-Akt通路、誘導EMT、促進腫瘤發生發展的重要影響因子。

2.3 LC與BMI1

LC的發病率占頭頸部惡性腫瘤的13.9%，以鱗狀細胞癌最常見[38]。Fernandes等[39]使用干細胞表面標記物CD44、CD133和CD117，將LC細胞區分為喉癌干細胞(laryngeal cancer stem cells,LCSCs)和喉癌非干細胞(non-LCSCs),證實了LC細胞株Hep-2的LCSCs亞群具有更強的致瘤潛能。LC常伴有低氧應激，在低氧條件下，LC細胞株Hep-2和AMC-HN-8顯示出G0/G1期的擴增細胞，并表現出缺氧誘導因子的上調，以及干細胞基因OCT4、SOX2和NANOG表達增加和CD133的優先表達[40]。CD133是廣泛認可的LCSCs標志物之一，Wei等[41]利用殼聚糖-甲氧基聚乙烯納米粒合成了沉默BMI1基因的CD133+Hep-2腫瘤細胞(mPEG-CS-BMI1RNAi-NPs)，將其與紫杉醇共培養時，CD133+BMI1RNAi細胞對化療的敏感性較CD133+Hep-2腫瘤細胞增強，侵襲能力降低，證明BMI1的表達是CD133+LCSCs致瘤性的核心。研究顯示BMI1過表達可顯著抑制喉癌細胞系Hep-2的放化療敏感性，促進喉鱗狀細胞癌的進展[42]。有趣的是，單獨BMI1基因的過表達并不能促使細胞癌變。Tan等[22]研究報道，單獨轉染BMI1的原代喉上皮細胞在裸鼠體內不具有活體成瘤的特征。另一項實驗證明，未經致癌物4-NQO誘導的BMI1異位過表達轉基因鼠不發生癌變[26]。證明了BMI1需要與其他影響因子互相作用，發揮致癌性。大多數癌癥通過DNA的逆轉錄合成來激活端粒酶并延長端粒，以避免細胞死亡和獲得無限增殖能力。而BMI1可通過特異性激活上皮來源細胞的端粒酶，誘導喉上皮細胞永生化。Tan等[22]研究人員將BMI1基因轉導入HSG，發現細胞中HTERT和磷酸化Rb的表達明顯增強并保持穩定，HTERT表達上調是細胞無限復制的最常見途徑，由此克服穩定傳代的壽命限制，衰老細胞減少，細胞增殖能力顯著上升。

3 BMI1與頭頸鱗癌的治療

3.1 BMI1靶向治療

到目前為止，化療、放療和手術治療仍然是HNSCC的常規治療方法，由于CSCs存在化療耐藥和放射治療耐受性，使其能夠逃脫放化療的殺傷。已知頭頸癌干細胞對5-氟尿嘧啶、順鉑、多西紫杉醇、西妥昔單抗和PI3K抑制劑(ZSTK474和PX-866)有耐藥性[39]。目前，抗程序性死亡受體-1(programmed death-1,PD-1)的免疫檢查點抑制劑和化療藥物的聯合療法已被批準用于復發性或轉移性頭頸癌的一線治療，對HNSCC的治療效果有所改善。但患者對該聯合療法的客觀應答率不高，中位應答持續時間相對較短[4]。此外，Jia等[4]發現，在HNSCC中聯合應用抗PD-1單抗和順鉑可以促使非干細胞腫瘤細胞的凋亡，卻不能有效針對可逃避CD8+T細胞殺傷作用的BMI1+CSCs，反而造成了病灶處BMI1+CSCs的富集，最后導致腫瘤復發機率上升。最近的一項研究表明，BMI1參與了RAD51依賴的復制應激反應(replication stress,RS)，當使用BMI1抑制劑時，乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells,bCSCs)內RS大量增加，這導致了bCSCs的化療敏感性上升，最終bCSCs比例降低[43]。因此，靶向破壞CSCs將成為治療的新方向。BMI1作為與CSCs密切相關的調節因子，靶向BMI1小分子是控制癌癥進展的有效途徑。2014年，Kreso研究團隊首次發現BMI1特異性抑制劑PTC-209可在腫瘤組織內負調控BMI1、抑制結腸及直腸癌細胞的生長，可對大腸癌起始細胞造成長期且不可逆轉的損害[44]。PTC209現已逐漸應用于膽道癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、慢性粒細胞白血病和多發性骨髓瘤等癌癥治療的研究中[43,45]。在HNSCC中使用PTC209或敲除BMI1基因后，聯合抗PD-1單抗或順鉑治療可募集和激活CD8+T細胞，誘導腫瘤細胞的內源性免疫反應，增強藥物對CSCs的殺傷作用。經觀察發現，使用該聯合治療方案的HNSCC細胞中BMI1+腫瘤細胞稀少存在或未能檢測到，細胞侵襲性降低，病灶面積更小甚至無法檢測到病灶，復發率更低[4,46]。由此，筆者認為靶向BMI1+CSCs將成為癌癥臨床治療的重要探索方向。2018年，Dey等[47]首次報道了第二代BMI1特異性抑制劑PTC-028，其通過誘導BMI1過度磷酸化而逐漸耗竭，激活Caspase依賴的細胞凋亡，顯著影響卵巢癌細胞的克隆生長與活力。在卵巢原位癌小鼠模型中，口服PTC-028具有單藥抗腫瘤活性，與順鉑或紫杉醇腹腔注射療效相似。而PTC-596作為另一種常用小分子BMI1抑制劑，可特異性誘導BMI1蛋白在納米分子水平上降解，導致急性髓細胞性白血病細胞系和原代母細胞的線粒體凋亡且對正常造血細胞無影響。目前已進入晚期實體腫瘤患者的第一階段臨床試驗(NCT02404480)[45]。

3.2 放射治療

放化療常作為晚期及復發性惡性腫瘤的重要治療手段，但電離輻射會引起口腔黏膜炎、口干、放射性骨壞死和第二原發腫瘤等一系列并發癥[34]。有研究報道，頭頸部CSCs細胞在接受2.5 Gy至高達10 Gy劑量的電離輻射處理后，評估CSCs的球體遷移及存活率，結果顯示球體遷移區域沒有顯著變化，且細胞活性測定觀察到CSCs的高存活率，證實其極強的抗輻射能力[48]。Hu等[34]采用體外培養的正常人角質形成細胞系HaCaT進行放療，經照射后的HaCaT細胞中BMI1表達顯著上調，且與X射線照射時間成正比。多項研究報道稱，當敲除BMI1基因或靶向BMI1高表達的 CSCs時，頭頸癌[27]、乳腺癌[9]、直腸癌[49]、肝癌[50]等CSCs的放射敏感性顯著增加。因此，減少輻射抵抗的影響因子、增強腫瘤放療敏感性對于提高頭頸癌臨床療效至關重要。由此可認為，BMI1是治療頭頸癌等實體瘤的可行靶點，具有較大的研究意義。

4 總 結

迄今為止，各研究報告顯示BMI1的異常表達可對CSCs的增殖、分化、腫瘤形成和對放化療的耐受性產生影響，導致患者治療效果不佳，其作為HNSCC CSCs標志物的證據豐富。相比于使用單個基因作為生物標志物，將BMI1結合CD44、CD133、ALDH1及OCT4等共表達組合可提高腫瘤干細胞識別精度[27]。筆者認為，未來仍需深入研究BMI1在p16、p53、Twist1、Snail、PTEN、RAD51及Rb等上下游調控因子中的作用及引發的后續效應，進一步探討BMI1與PTEN、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)相互作用后激活的PI3K-Akt通路，以及BMI1誘導端粒酶活性和驅動EMT等過程對HNSCC病程發展的影響。此外，合理應用BMI1的靶向藥物，可協同現有的腫瘤治療策略，優化HNSCC治療方案，提高BMI1+CSCs細胞的殺傷率，降低疾病復發率。對于不同頭頸區域的鱗癌，其生理解剖特點及癌癥生物學特性存在差異，后續研究仍需關注BMI1對于各部位頭頸腫瘤干細胞的異質性，以探索頭頸部鱗癌的差異化、精準化治療。

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