柴胡加龍骨牡蠣湯對急性心肌梗死合并焦慮大鼠海馬A型利鈉肽及其受體的調節作用

王威，陳雅麗，張秀靜，王帥，馬迪，趙海濱

（1.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078）

流行病學調查顯示，約有52.5%的急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者在心肌梗死介入術后伴有焦慮[1-2]。冠心病事件及心源性猝死的發生風險隨焦慮程度的提高而增加，且焦慮狀態對AMI患者長期預后存在不良影響[3]。研究證實，焦慮過度激活下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸，導致血小板聚集作用增強，冠狀動脈痙攣、心肌缺血，加重AMI的發生[4]。而A型利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）能夠抑制HPA軸活性，減少AMI的發生率，緩解患者的焦慮狀態[5-6]。本研究在前期臨床應用柴胡加龍骨牡蠣湯有效治療AMI合并焦慮的基礎[7-8]上，進一步探討柴胡加龍骨牡蠣湯對AMI合并焦慮大鼠海馬ANP及其受體水平的調節作用，以期為臨床應用提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 18只SPF級健康6周齡雄性SD大鼠，體質量180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證編號：SCXK（京）2016-0006。動物飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，喂飼常規大鼠飼料及飲用水。本實驗方案已經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 藥物、試劑與儀器 實驗所用中藥方劑源自《傷寒論》中的柴胡加龍骨牡蠣湯。具體成分如下：柴胡12 g、黃芩9 g、龍骨15 g、牡蠣15 g、黨參9 g、桂枝9 g、茯苓15 g、半夏9 g、大黃9 g、珍珠母（代鉛丹）15 g、生姜9 g、大棗10 g。實驗使用中藥顆粒劑，配方顆粒購自北京康仁堂藥業有限公司。兔多抗ANP、兔多抗利尿鈉肽A型受體（NPRA）（武漢三鷹生物技術有限公司）；兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒（Q311-03，南京Vazyme公司）。小動物呼吸機（上海奧爾科特生物技術有限公司）；小動物超聲影像系統（加拿大Visual Sonics公司）；標準規格酶標儀（美國Thermo Scientific公司，型號：Multiskan MK3）；自動洗板機（北京拓普分析儀器有限公司，型號：DEM-3）；離心機（美國Sigma公司，型號：3K18）；PCR儀（美國ABI公司，型號：9700）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司，型號：LC480II）。

1.3 建模 本實驗依據前期造模研究[9]基礎，采用不確定空瓶刺激法結合冠狀動脈左前降支結扎建立AMI合并焦慮模型，即復合模型。

焦慮模型：參照文獻及前期研究，采用不確定空瓶刺激法。建模周期21 d，建模期間大鼠自由攝食。第1～7天進行定時喂水訓練，每日上午8∶00～8∶10和晚上20∶00～20∶10給予飲水，其他時段禁水讓大鼠處于口渴狀態。第8～21天進行空瓶應激，每日早晚隨機選取一個飲水時間段給予空瓶，誘發其情緒應激，另一時間段給予喂水。

AMI模型：采用左冠狀動脈前降支結扎法構建AMI模型。將大鼠稱質量后用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，備皮，消毒，固定大鼠，氣管插管，連接小動物呼吸機。沿大鼠胸骨旁左側第3～4肋間方向切開皮膚，逐層分離皮下組織、肌肉，打開心包膜。用5.0縫合線，于心耳邊緣下2 mm處結扎左冠狀動脈前降支，進針深度控制在1 mm、寬度1～2 mm，收線打結。術中肉眼可見結扎線遠端左室前外側壁心肌變白區，逐層關閉胸腔。后移除呼吸機，輕捏大鼠胸廓，輔助其恢復呼吸。術后腹腔注射0.2 mL利多卡因防止心律失常、40萬U青霉素預防術后感染。術中及術后大鼠蘇醒前注意保暖。術后第2天行心電圖，導聯I、aVL、V1～V6中有6個及以上導聯出現病理性Q波即為AMI模型構建成功。假手術組僅穿線后打松結，余步驟相同。

復合模型：即AMI合并焦慮模型，在不確定空瓶刺激建模的第15天對大鼠實行心肌梗死手術，繼續給予空瓶刺激，至第21天造模完成。

1.4 分組與給藥 分組：心肌梗死術后第2天根據心電圖I、aVL、V1～V6導聯中的病理性Q波進行區組隨機分組。本實驗共設計3組，將AMI成模大鼠分為AMI合并焦慮模型組（復合模型組）、柴胡加龍骨牡蠣湯組（中藥組），另設假手術組，每組6只大鼠。

給藥：根據本團隊前期實驗中藥劑量篩選，中藥組大鼠給藥量按照成人（體質量60 kg）的6倍劑量折算，折合大鼠日生藥劑量為13.6 g/kg，每劑中藥顆粒用蒸餾水100 mL混勻。中藥組大鼠心肌梗死術后第2天給予柴胡加龍骨牡蠣顆粒劑（10 mL/kg）灌胃，每日1次；假手術組和模型組術后第2天給予蒸餾水（10 mL/kg）灌胃，每日1次。至建模第22天處死動物，取海馬組織。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 超聲心動圖檢查 將大鼠稱質量后用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，左前胸大面積備皮，取左心室短軸切面，探測M型曲線，主要檢測大鼠的左室收縮末內徑（LVIDs）、左室舒張末內徑（LVIDd）、左室短軸率（FS）、左室射血分數（EF）。每只大鼠取3個連續心動周期，取平均值。

1.5.2 曠場實驗（OFT） 本實驗采用體積為

100 cm×100 cm×40 cm的木制黑箱，底板畫有25個正方形格子。在安靜、弱光的環境下進行。先讓大鼠適應性活動5 min，再將大鼠放在箱底中央格，開始計時并攝像，觀察6 min內大鼠的活動情況。記錄大鼠在敞箱內水平運動格子數、垂直運動次數以及中央停留區時間。

1.5.3 高架十字迷宮實驗（EPM）該實驗裝置由兩條相對開臂（50 cm×10 cm）和相對閉臂（50 cm×10 cm×40 cm）組成，中央有一開闊區（10 cm×10 cm），十字迷宮離地面50 cm。先讓大鼠自由活動5 min，再將大鼠面向開放臂放入，開始計時并錄像，觀察5 min內大鼠在開臂和閉臂的活動情況，記錄大鼠進入開臂次數（OE）和停留時間（OT），進入閉臂次數（CE）和停留時間（CT），計算OE/（OE＋CE）和OT/（OT＋CT）的比值。

1.5.4 采用尼氏染色法觀察大鼠海馬病理變化 大鼠麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，用灌流針自左心室插入，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌流固定，摘取海馬浸泡于組織固定液中，靜置48 h后制備切片，觀察海馬尼氏染色情況。

1.5.5 RT-PCR法檢測大鼠海馬ANP及NPRA mRNA表達水平 將大鼠海馬樣本組織進行RNA提取，再將待測RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄完畢后加入90μL Nuclease-free H2O儲存在-20℃冰箱備用。引物采用Roche LCPDS2軟件設計并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ANP上游引物序列為5’-CTTTCCTGAGAATGAACGTGT-3’，下游引物序列為5’-TCCTCCTCTTCTAGCAGATAGT-3’，擴增長度118 bp；NPRA上游引物序列為5’-TAT GGCAATGTGCTGACTGAA-3’，下游引物序列為5’-AGGCTGGAGCAAAGCTAAA-3’，擴增長度97 bp；ACTB上游引物序列為5’-GCGAGTACAACCTTCT TGC-3’，下游引物序列為5’-TATCGTCATCCATG GCGAAC-3’，擴增長度72 bp。利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒（Q311-03，Vazyme）在LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀上進行反應。體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，5μL；10μmol/L Forward primer，0.2μL；10μmol/L Reverse primer，0.2μL；cDNA，1μL；Nuclease-free H2O，3.6μL。PCR程序：95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40個循環。循環結束后，采用2-△△CT法利用熔解曲線檢測產物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每1℃采集5次熒光信號。

1.5.6 Western Blot法檢測大鼠海馬ANP及NPRA蛋白表達情況 將海馬組織充分裂解，離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度，取樣品蛋白水浴10 min變性。加樣后進行電泳1.5 h，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加ANP、NPR、GAPDH一抗4℃孵育過夜。次日，加二抗常溫孵育2 h，滴加ECL試劑顯色、曝光、定影，沖洗膠片。最后用BandScan軟件分析膠片灰度值。結果以目的蛋白與內參蛋白GAPDH灰度值比值表示。

1.6 統計方法 數據均采用Excel表整理，采用SPSS 17.0統計分析軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示。將多組獨立樣本進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，如方差齊則采用單因素方差分析，方差不齊采用獨立樣本秩和檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠超聲心動圖指標比較 圖1結果顯示：與假手術組比較，復合模型組左室EF及FS值明顯下降（P＜0.01），LVIDs和LVIDd明顯增加（P＜0.01）；與復合模型組比較，中藥組左室EF及FS值升高（P＜0.01），LVIDs和LVIDd下降（P＜0.01）。表明AMI合并焦慮大鼠左心室功能降低，而柴胡加龍骨牡蠣湯對大鼠心功能有所改善。

圖1 各組大鼠超聲心動圖指標比較Figure 1 Comparison of echocardiographic indices among various groups of rats

2.2 各組大鼠行為學指標比較 曠場實驗結果如圖2-A～B所示：與假手術組比較，復合模型組大鼠水平運動得分和垂直運動得分均顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與復合模型組比較，中藥組大鼠水平運動得分和垂直運動得分有所上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。

高架十字迷宮實驗結果如圖2-C～D所示：與假手術組比較，復合模型組大鼠傾向于待在閉臂里，待在開臂的次數和時間比值均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與復合模型組比較，中藥組的大鼠更傾向于待在開臂里，待在開臂的次數和時間比值均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。表明AMI合并焦慮可引起大鼠生理心理狀態的改變，影響大鼠行為，柴胡加龍骨牡蠣湯可有效改善AMI合并焦慮大鼠的焦慮狀態。

圖2 各組大鼠行為學指標比較Figure 2 Comparison of behaviouralindicators among various gruops of rats

2.3 各組大鼠海馬尼氏染色結果 圖3結果顯示：假手術組神經細胞排列緊密；與假手術組比較，復合模型組神經細胞排列松散，尼氏小體數量減少；與復合模型組比較，中藥組尼氏小體數量明顯增加。尼氏體是神經元內蛋白質合成的重要部位，當神經元受到刺激后，胞體內的尼氏體會明顯減少。復合模型組大鼠尼氏小體數量明顯減少，表明AMI合并焦慮可引起大鼠神經元結構改變，而柴胡加龍骨牡蠣湯可保護AMI合并焦慮大鼠海馬的結構和功能。

圖3 各組大鼠海馬尼氏染色結果（×20）Figure 3 Results of Nissl’s staining in the hippocampus of various groups of rats（×20）

2.4 各組大鼠海馬ANP及其受體mRNA相對表達量比較 圖4結果顯示：與假手術組比較，復合模型組ANP與NPRA mRNA相對表達量均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與復合模型組比較，中藥組ANP與NPRA mRNA相對表達量均明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。ANP需與其相應受體結合才能發揮作用，ANP分泌增加，對維持心臟的基本生理功能具有重要意義，具有顯著的心臟保護作用。結果表明，柴胡加龍骨牡蠣湯可提高AMI合并焦慮大鼠海馬ANP及其受體的mRNA表達水平，從而發揮應激性心肌保護作用。

圖4 各組大鼠海馬ANP及NPRA mRNA相對表達量比較Figure 4 Comparison of the mRNA relative expression levels of ANP and NPRA in thehippocampus among various groups of rats

2.5 各組大鼠海馬ANP及其受體蛋白表達量比較 考慮到ANP與其相應受體相結合才能發揮其正常的生物學作用，尤其是與NPRA的結合，因此，對海馬組織中NPRA蛋白表達水平也進行了檢測。圖5結果顯示：與假手術組比較，復合模型組ANP與NPRA蛋白相對表達量均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與復合模型組比較，中藥組ANP與NPRA蛋白相對表達量均明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠海馬ANP及NPRA蛋白表達比較Figure 5 Comparison of protein expression of ANP and NPRA in the hippocampus among various groups of rats

3 討論

研究[10]證實，精神心理疾病是心血管疾病的獨立危險因素，尤以焦慮與心血管疾病的關系最為密切。A型利鈉肽（ANP）是一種具有生物學作用的肽類激素，需與利尿鈉肽A型受體（NPRA）結合才能發揮其生物學效應，因此，NPRA的基因表達量和受體功能活性決定ANP生物效應。ANP主要在心房合成、儲存并分泌入血。在腦組織中，ANP由特定的神經元合成與分泌，以下丘腦含量最高。因此，機體存在心臟和中樞2個獨立的利鈉肽系統，ANP不僅在心血管疾病過程中發揮著至關重要的作用，也能夠有效地調節負面情緒，利鈉肽系統失調可能成為焦慮發病的機制[11]。海馬與人類學習、認知、記憶和控制機體情感等行為學功能密切相關，其作為應激影響的敏感部位，擔負著HPA軸負反饋的高位調節中樞角色[12]。本實驗海馬病理結果顯示，復合模型組大鼠尼氏小體數量較假手術組明顯減少，表明AMI合并焦慮大鼠海馬結構功能受損。這也證實ANP是一種具有抗焦慮作用的神經調節劑，海馬ANP、NPRA激活后可抑制HPA軸活性，改善焦慮狀態。

急性心肌梗死（AMI）屬于中醫學“胸痹”的范疇。張仲景《金匱要略》中就對胸痹進行了系統的闡述，說明其病機關鍵為心脈痹阻。焦慮屬于中醫學“郁病”的范疇，由于情志不暢，氣機郁滯，以致心神不安，臟腑失調。《靈樞·本神篇》提出“心藏脈，脈舍神”，故心、神二者是一個有機的整體。朱丹溪《丹溪心法》云：“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉。”臨床研究表明，心血管系統疾病患者存在明顯的焦慮、抑郁等負性情緒，情志不暢，使氣機紊亂，氣血失調，易引發機體內環境變化，導致心血管疾病的發生、加速其發展[13-15]。作為心臟疾病的兩個方面，將AMI（胸痹）和焦慮（郁病）作為一個整體來考慮，根據共同的病理因素用藥物進行干預，同時兼顧心臟疾病及精神心理狀況。本研究所選方劑柴胡加龍骨牡蠣湯來源于我國經典醫學論著《傷寒論》，是在小柴胡湯去掉甘草的基礎上加用龍骨、牡蠣、茯苓、桂枝、大黃而成，方中：主以柴胡疏表達里、調暢三焦、舒暢氣血津液，加龍骨、牡蠣以鎮肝膽之驚；取柴胡、黃芩為伍，解未盡之表邪，清泄少陽郁熱，可使邪郁得透，氣郁能達，火郁得清；大黃苦寒泄熱，攻已陷之里熱；桂枝溫通經絡，合大黃活血通絡；茯苓、珍珠母寧心安神定志，半夏降逆化痰；黨參、大棗、生姜補虛而安神，以培養其胃，調和諸藥。本研究結果顯示：與復合模型組比較，中藥組海馬尼氏小體增多，海馬ANP及NPRA的mRNA、蛋白表達水平升高。表明柴胡加龍骨牡蠣湯可提高海馬ANP、NPRA表達水平，有效改善AMI合并焦慮大鼠心功能及焦慮狀態。

綜上所述，柴胡加龍骨牡蠣湯可有效改善AMI合并焦慮大鼠心功能及焦慮狀態，考慮其可能通過升高大鼠海馬ANP、NPRA mRNA及蛋白表達水平，抑制HPA軸活性，從而減少AMI的發生率，緩解焦慮狀態。