血根堿通過TGF-β1/Smad通路抑制化療耐藥性宮頸癌細胞的增殖

湯麗麗，郭潔，李晶，劉蓉，范曉靜

（1.邯鄲市第一醫院婦產科，河北邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫院紡醫院區麻醉科，河北邯鄲 056002；3.邯鄲市第一醫院財務科，河北邯鄲 056002）

宮頸癌（cervical cancer）是女性常見的惡性腫瘤。鉑類抗腫瘤藥物是宮頸癌重要的化療藥物，包括順鉑（cisplatin，DDP）、卡鉑等[1-2]。臨床中，DDP比卡鉑更常用，但患者DDP耐藥性的產生限制了DDP的廣泛應用[3-4]。因此，提高宮頸癌細胞的DDP敏感性和逆轉DDP耐藥性具有重要的研究意義。來源于植物的天然產物在抗腫瘤藥物領域占有重要的地位[5-6]。血根堿（sanguinarine）是從白屈菜、博落回罌粟科植物中提取的一種苯菲啶異喹啉類生物堿，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗真菌，改善肝功能，提高免疫力等多種藥理活性[7-10]。近年研究發現，血根堿具有抗腫瘤作用，可有效抑制結直腸癌、胰腺癌和乳腺癌等[11-13]；但尚未見其在宮頸癌中應用的研究。因此，本研究以DDP耐藥的人宮頸癌Hela細胞（HeLa/DDP）為模型，探討血根堿對HeLa/DDP細胞增殖的影響，以期闡明血根堿抗宮頸癌DDP耐藥的作用及機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養 人宮頸癌HeLa細胞，購自上海奧陸生物科技有限公司。HeLa細胞以含有10%胎牛血清、100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL鏈霉素的DMEM培養基在5%CO237℃條件下培養。

1.2 藥物、試劑與儀器 血根堿（≥98%，成都曼思特生物科技有限公司生產，分子式：C20H14NO4；分子量：332.33）；DDP，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產，批號：C295225。轉化生長因子β1（TGF-β1）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；10%胎牛血清、DMEM培養基（美國Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測試劑盒、蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；牛血清白蛋白（BSA）（美國Millipore公司）；TGF-β1、p15、Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、β-肌動蛋白（β-actin）等鼠抗兔多單克隆抗體（英國Abcam公司）；含有辣根過氧化物酶（HRP）結合的山羊抗兔IgG抗體（美國CST公司）；ECL發光液（美國Thermo Fisher Scientific公司）。Synergy H4全功能酶標儀（美國BioTek公司）；PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR一體式凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 順鉑耐藥細胞株HeLa/DDP模型構建 取處于對數生長期的HeLa細胞，以100倍半數抑制濃度（IC50）為誘導劑量，用DDP誘導培養2 h后撤去含藥培養基，用PBS漂洗3次，加入常規培養基繼續培養，每天換液去除死細胞。10～15 d后，存活的細胞生長恢復，進入對數生長期后進行消化處理。傳代3次后，重復上述操作4次。之后延長藥物作用時間為4 h，重復8次。總計加藥作用12次，誘導過程共歷時6個月，最后得到DDP耐藥細胞株HeLa/DDP。

1.4 實驗分組 分3組：Hela/DDP組、Hela/DDP+DMSO組、Hela/DDP+血根堿組。Hela/DDP組為空白對照組，只給予原培養基處理；Hela/DDP+血根堿組為血根堿處理組，給予2μmol/L血根堿[14]（0.1%DMSO為溶媒）處理；Hela/DDP+DMSO組為陰性對照組，給予與血根堿相同體積的溶媒0.1%DMSO處理。

在隨后的拯救實驗中，分4組：DMSO組、血根堿組、生理鹽水+血根堿組、TGF-β1+血根堿組。DMSO組、血根堿組的處理方式與上述分組相同；TGF-β1+血根堿組給予5 ng/mL TGF-β1[15]（以生理鹽水為溶媒）預處理6 h，然后加入2μmol/L血根堿后培養72 h；生理鹽水+血根堿組給予相同體積的生理鹽水合相同濃度的血根堿進行處理。

1.5 MTT法測定HeLa/DPP細胞增殖能力 將HeLa/DDP細胞接種于96孔板中，2×104/孔，在DMEM培養基中培養6 h。隨后按照“1.4”項分組處理24、48、72 h。將MTT（5 mg/mL）加入培養基中，并用150μL DMSO溶解甲臜晶體。應用酶標儀以490 nm波長讀取吸光度（OD）數值。計算細胞生長抑制率，公式：細胞生長抑制率（%）=（對照組OD平均值-實驗組OD平均值）/對照組OD平均值×100%。并計算半數最大抑制濃度（IC50）。

1.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測HeLa/DDP細胞TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p15蛋白表達 將HeLa/DDP細胞接種到48孔板中，2×105/孔，細胞貼壁6 h后再按照“1.4”項分組處理72 h。用蛋白提取試劑盒提取細胞內蛋白并通過BCA法測定蛋白質濃度。每個泳道上樣15μg蛋白質進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE），然后將分離膠上的蛋白樣本電轉到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。膜在室溫下用TBST溶解的5%BSA封閉40 min。然后將膜與指定的一抗[TGF-β1（稀釋比1∶1 000）、p-Smad2（稀釋比1∶2 000）、Smad2（稀釋比1∶2 000）、p15（稀釋比1∶1 000）和β-actin（稀釋比1∶2 000）]在4℃孵育過夜，在室溫下用HRP標記的山羊抗兔二抗（稀釋比1∶5 000）孵育40 min。每個步驟完成后采用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次5 min。應用ECL發光液顯影。最后，采用ImageJ軟件分析電泳條帶，結果以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度值比值表示。

1.7 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，然后進行最小顯著性差異檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌Hela/DDP細胞株模型的建立 以親本宮頸癌細胞系HeLa為基礎，建立DDP耐藥細胞株HeLa/DDP模型。采用MTT法觀察HeLa細胞系DDP耐藥水平。對DDP敏感的HeLa和DDP耐藥的HeLa/DDP細胞用不同濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL）的DDP處理48 h，確立半數最大抑制濃度（IC50）值分別為5.821μg/mL和28.88μg/mL，結果見圖1。HeLa/DDP細胞系的IC50值約是HeLa細胞系的5倍，表明HeLa/DDP對DDP的耐藥性明顯高于HeLa細胞。

2.2 血根堿抑制HeLa/DDP細胞的增殖 為了觀察血根堿對Hela/DDP細胞增殖的影響，給予血根堿處理HeLa/DDP細胞24、48、72 h。圖2結果顯示，與未經血根堿處理的細胞相比，血根堿處理的HeLa/DDP細胞的生長抑制率顯著增加（P＜0.05），表明血根堿可以抑制HeLa/DDP細胞的增殖。

圖2 MTT法測定HeLa/DDP細胞生長抑制率結果Figure 2 Results of the growth inhibition rate of HeLa/DDP cells by MTT assay

2.3 血根堿通過TGF-β1/Smad信號通路調控Hela/DDP細胞增殖 采用Western Blot法檢測血根堿誘導Hela/DDP細胞TGF-β1/Smad通路中TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達水平，結果如圖3所示：與Hela/DDP+DMSO組比較，Hela/DDP+血根堿組中的TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達水平降低（P＜0.05）；同Hela/DDP組相比較，Hela/DDP+DMSO組0.1%DMSO對上述3種分子的蛋白表達無明顯影響。

圖3 血根堿對Hela/DDP細胞轉化生長因子（TGF）-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達的影響Figure 3 Effect of sanguinarine on protein expressions of TGF-β1，p-Smad2/Smad2 and p15 in Hela/DDP cells

2.4 TGF-β1緩解了血根堿誘導的Hela/DDP細胞增殖抑制 本研究進行了拯救實驗，以5 ng/mL TGF-β1對Hela/DDP細胞進行了預處理。圖4結果顯示：與生理鹽水+血根堿組比較，TGF-β1+血根堿組Hela/DDP細胞生長抑制率顯著下降（P＜0.05）；血根堿組與生理鹽水+血根堿組間Hela/DDP細胞生長抑制率比較無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 轉化生長因子（TGF）-β1對血根堿誘導Hela/DDP細胞增殖的影響Figure 4 Effect of TGF-β1 on the proliferation of sanguinarine-induced Hela/DDP cells

2.5 TGF-β1緩解了血根堿誘導Hela/DDP細胞的TGF-β/Smad信號失活 此外，TGF-β1還逆轉了血根堿所誘導的Hela/DDP細胞Smad2磷酸化和p15的表達抑制。圖5結果顯示，TGF-β1+血根堿組Hela/DDP細胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15的蛋白表達水平明顯高于生理鹽水+血根堿組（P＜0.05），表明TGF-β1可以緩解血根堿誘導Hela/DDP細胞的TGF-β1/Smad信號失活。

圖5 轉化生長因子（TGF）-β1對血根堿誘導Hela/DDP細胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達的影響Figure 5 Effects of TGF-β1 on protein expressions of TGF-β1，p-Smad2/Smad2 and p15 in sanguinarineinduced Hela/DDP cells

3 討論

順鉑（DDP）對晚期或復發性宮頸癌治療最為有效[16]。越來越多的證據表明，靶向線粒體、誘導DNA損傷進而導致細胞凋亡是DDP化療治療宮頸癌的主要作用[17-18]。然而，基于DDP化療的內在或獲得性耐藥已成為許多癌癥治療中的挑戰。血根堿具有良好的抗腫瘤活性，本研究發現，2μmol/L血根堿顯著降低了HeLa/DDP細胞的增殖。

TGF-β/Smads信號轉導通路在腫瘤的發生機制中發揮了重要作用。TGF-β超家族信號通路調控著復雜的基因表達反應，并因不同生理和病理環境而變化，其在多個水平上廣泛地調節維持體內平衡。TGF-β信號通過與膜上特異性受體結合發生信號級聯反應，依次激活并磷酸化胞內Smad蛋白形成TGF-β/Smad復合物，隨后移入細胞核調節相關靶基因轉錄反應。調節過程中任何信號轉導因子發生異常都可導致或促進腫瘤的發生和發展[19-20]。有研究表明，TGF-β1與宮頸癌的發生發展密切相關[21]。Smad2蛋白在宮頸癌組織中表達減少，與宮頸癌浸潤程度、癌細胞分化程度密切相關[22-23]。p15基因是腫瘤抑制基因的候選基因，受細胞生長抑制蛋白TGF-β1的誘導，對細胞周期起負調控作用[24]。TGF-β1可調節周期蛋白復合物的活性并通過抗增殖機制直接誘導p15基因轉錄，對于細胞周期從G1期向S期進化的關鍵過程至關重要[25]。TGF-β1調節p15基因的表達，Smad2與Sp1合作誘導p15轉錄以響應TGF-β1[26]。本研究結果顯示，血根堿可以明顯抑制HeLa/DDP細胞TGF-β1、p-Smad/Smad和p15的蛋白表達。本研究中拯救實驗還驗證了血根堿對TGF-β1/Smad信號通路的調控作用，認為血根堿抑制HeLa/DDP細胞的增殖可能是通過TGF-β1/Smad信號通路實現的。

綜上所述，血根堿可抑制HeLa/DDP細胞的增殖，其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路有關。