基于網絡藥理學和分子對接探討虎杖治療膿毒癥的作用機制

李樂，黃浩，羅苑苑，溫敏勇

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

膿毒癥（sepsis），被定義為機體對感染反應失調所引起的危及生命的器官功能障礙[1-2]，是現代醫學危急重癥領域中的熱點與難點。膿毒癥歸屬于中醫學“外感熱病”“溫毒”等范疇。中醫藥在膿毒癥治療領域具有廣泛的應用前景[3-4]。虎杖是蓼科多年生草本植物虎杖（Polygonum cuspidatumSieb.etZucc.）的干燥根莖和根，別名花斑竹、大葉蛇總管、陰陽蓮等，性寒，味苦，歸肝、膽、肺經[5]，具有清熱利濕解毒、活血散瘀止痛、止咳化痰的功效，臨床常用于治療濕熱蘊結下焦、肺熱咳嗽、熱結便秘、水火燙傷等病證。現代藥理研究發現，虎杖中主要含有蒽醌類（大黃素、大黃酸、大黃酚等），二苯乙烯類（虎杖苷、白藜蘆醇等），黃酮類（橙皮素、蘆丁、槲皮素等），香豆素類以及一些脂肪酸類化合物，能通過抗炎、抗氧化、改善細胞連接、抗細胞凋亡等多種作用改善膿毒癥預后[6-12]。但虎杖治療膿毒癥過程中的關鍵成分及其具體機制仍不明確，因此本研究通過網絡藥理學和分子對接技術預測虎杖在膿毒癥治療中的主要活性成分及核心靶標，以期為虎杖在膿毒癥治療領域的進一步開發利用提供參考，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 虎杖有效成分及靶標的檢索及篩選 選擇中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，獲得虎杖的有效成分，同時結合相關文獻及數據庫進行補充。再利用TCMSP靶標預測模型獲得虎杖有效成分的作用靶標。

1.2 疾病靶標的篩選 以“sepsis”為檢索詞，分別在GeneCards、OMIM數據庫進行關鍵詞檢索，將獲得的靶標進行合并、去重，得到膿毒癥的疾病靶標。把檢索得到的膿毒癥靶標與虎杖有效成分靶標通過R軟件合并處理，取兩者交集并繪制韋恩圖。

1.3 藥物-成分-靶標網絡的構建 把虎杖的有效成分、藥物與疾病交集靶標導入Cytoscape 3.8.0軟件中，剔除孤立的有效成分及靶標數據，得到藥物-成分-靶標網絡，節點表示虎杖、有效成分及潛在靶標。再使用軟件自帶的網絡分析工具計算網絡拓撲參數，根據節點連接度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及緊密度中心性（Closeness Centrality）對網絡圖的網絡拓撲結構進行分析。同時把藥物與疾病的交集靶標導入STRING 11.0數據庫中，限定物種為人類（Homo sapiens），最低相互作用閾值為0.4，獲取蛋白之間相互作用的關系數據，再導入Cytoscape 3.8.0中繪制蛋白互作網絡（PPI）圖。

1.4 基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將藥物與疾病的交集靶標通過R軟件的Cluster Profiler包進行GO富集分析和KEGG通路分析，以P＜0.05和Q＜0.05作為篩選條件，得到差異有顯著性意義的生物過程和靶標通路并繪制相關的柱狀圖。

1.5 分子對接結果驗證 選擇虎杖度值（Degree）前5位的有效成分作為配體，度值前5位的核心靶標作為受體，在RCSB數據庫（https://www.rcsb.org/）下載有效成分及靶標對應的PDB文件或mol2文件，采用Autodock軟件進行分子模擬對接。

2 結果

2.1 虎杖有效成分及靶標的篩選 在TCMSP中檢索虎杖，得到化合物62個。以OB≥30%及DL≥0.18為篩選條件，加以結合相關文獻篩查，共得到10個化合物（見表1）。得到虎杖作用靶標1 068個，通過與虎杖有效成分進行比對，去重后得到205個作用靶標。

表1 虎杖的有效成分Table 1 Active constituents of PolygoniCuspidati Rhizoma et Radix

2.2 膿毒癥靶標的篩選 在GeneCards、OMIM數據中，以“sepsis”為檢索詞檢索，經合并、去重后，得到膿毒癥的疾病靶標共2 890個。取藥物作用靶標與疾病靶標交集，得到63個交集基因靶標（見圖1），即虎杖治療膿毒癥潛在靶標。

2.3 “藥物-成分-靶標”網絡的構建 把虎杖的有效成分、藥物與疾病交集靶標導入Cytoscape 3.8.0軟件中，剔除孤立的節點后，得到藥物-成分-靶標網絡（見圖2），包含72節點，313條邊。其中，靶標節點有63個，有效成分節點7個。利用Cytoscape 3.8.0網絡分析工具計算網絡拓撲參數，分析得到虎杖中最主要的前7個有效成分為槲皮素（quercetin，度值=138），木犀草素（luteolin，度值=77），β-谷甾醇（beta-sitosterol，度值=11），毒扁豆次堿（physovenine，度值=9），大黃酚（rhein，度值=5），兒茶酚（catechin，度值=5），6，8-二羥基-7-甲氧基呫噸酮（6，8-dihydroxy-7-methoxyxanthone，度值=4）以及最主要的前22個基因（見表2）。

表2 虎杖治療膿毒癥的前22個主要靶標信息Table 2 Information on the top 22 major targets for PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix in the treatment of sepsis

圖2 虎杖治療膿毒癥“藥物-成分-靶標網絡”圖Figure 2“Drug-component-target network”diagram for Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.4 PPI網絡的構建 將63個交集基因導入STRING平臺構建藥物-疾病靶標PPI網絡，取最低相互作用閾值為0.4，得到PPI網絡數據。把PPI網絡數據導入Cytoscape 3.8.0中，經過分析得到網絡平均度值為19.4，最主要的前10個靶標分別是TP53（度值=49），IL6（度值=44），ESR1（度值=41），CASP3（度 值=41），HIF1A（度 值=40），VEGFA（度值=40），MYC（度值=39），EGFR（度值=39），PPARG（度值=37），CCND1（度值=35）。度值越大，說明該節點很可能就是關鍵成分或關鍵靶標（見圖3）。

圖3 虎杖治療膿毒癥的藥物-疾病靶標蛋白互作網絡圖Figure 3 Network diagram of drug-disease target protein interaction for Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 經過GO功能富集分析，得到1 321個GO條目，其中包含生物過程（BP）1 206個、細胞組成（CC）17個、分子功能（MF）97個。按校正P值從小到大選取每個分類的前8個條目繪制柱形圖（見圖4）。結果顯示，生物過程主要涉及細胞對化學應激的反應、氧化應激反應、活性氧代謝過程、藥物反應、凋亡信號通路的調控與負調控等；細胞組成則涉及膜筏、膜微區、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物、髓鞘、基底等離子體膜、核被膜等；分子功能涉及DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、泛素或泛素樣蛋白連接酶結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡過程、活化轉錄因子結合、氧化還原酶活性等。同時經過KEGG富集分析，共得到126條通路，按富集到通路上的靶標數目選取前20條通路繪制氣泡圖（見圖5），其中，最主要的有脂質與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、人類巨細胞病毒感染、細胞凋亡、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、AGE-RAGE信號通路等。結果表明，虎杖主要通過調節炎癥反應、免疫反應及脂質代謝等通路治療膿毒癥。

圖4 虎杖治療膿毒癥潛在靶標的GO功能分析Figure 4 GO functional analysis of potentialtargets of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix in the treatment of sepsis

圖5 虎杖治療膿毒癥潛在靶標的KEGG通路分析Figure 5 Analysis of the KEGG pathway for potential targets of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.6 活性成分與關鍵靶標分子對接結果 為明確所篩選的虎杖活性成分是否通過關鍵靶標發揮治療膿毒癥的作用，我們通過分子對接技術進行初步驗證。利用AutoDock軟件對度值前5位的有效成分與度值前5位的核心靶標進行分子對接，結果顯示分子與靶標最低結合能均小于0，表明配體與受體均可進行自發結合。見圖6。最低結合能≤-5.0 kJ·mol-1即表明藥效分子與蛋白對接效果良好。結合能越低，表明分子與蛋白結合能力越強。本研究大部分結合能均≤-5.0 kJ·mol-1，其中β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚的結合能均＜-5.0 kJ·mol-1，結合能力較強。TP53、PTGS1與有效成分結合能力為良好，代表有效成分可能主要通過這2個核心靶標治療膿毒癥。

圖6 虎杖有效成分與膿毒癥核心靶標分子對接結合能熱圖Figure 6 Molecular docking binding energy heat map of the active ingredients of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix and the core target molecules of sepsis

本研究選取結合能最低，即結合能力最強的有效成分與核心靶標在Pymol軟件繪圖（見圖7）。其中，β-谷甾醇和木犀草素與核心靶標的結合能力最強，β-谷甾醇分布與血管內皮生長因子（VEGFA）在PRO-28處及 與TP53在GLU-97、SER-93處形成氫鍵，木犀草素則與PTGS1在GLU-465、CYS-36、CYS-47處和與IL6在SER-46、THR-42、ASP-159、NLE-48處形成氫鍵，木犀草素的結合能力強于β-谷甾醇，而毒扁豆次堿與RELA在PRO-47處形成氫鍵。

圖7 虎杖有效成分與膿毒癥核心靶標分子對接模式圖Figure 7 Molecular docking diagram of the active components of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix with the core target molecules of sepsis

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法，篩選出7個虎杖主要活性成分，分別是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚、兒茶酚、6，8-二羥基-7-甲氧基呫噸酮，以及潛在的治療膿毒癥靶標63個。PPI網絡顯示度值前10位的靶標分別是TP53（49）、IL6（44）、ESR1（41）、CASP3（41）、HIF1A（40）、VEGFA（40）、MYC（39）、EGFR（39）、PPARG（37）、CCND1（35），表明這10個靶標是虎杖治療膿毒癥潛在的關鍵靶標。根據GO功能和KEGG富集結果顯示，這些靶標主要涉及PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF、MAPK等信號通路。這些信號通路與炎癥反應調節和免疫應答、細胞氧化應激、細胞自噬及凋亡密切相關。其中，PI3K-Akt信號通路可通過介導多種固有免疫細胞在膿毒癥炎癥反應與免疫應答的調控中發揮關鍵作用[13]。MAPK信號通路主要參與細胞生長分化、炎癥反應、氧化應激等多種生理過程，對該通路的調控可發揮抑制細胞凋亡、減輕膿毒癥器官損傷等作用[14]。嚴重感染、器官功能障礙以及免疫失衡始終是膿毒癥病程中較為突出的幾大難題，因此，本研究結果提示，虎杖在膿毒癥治療中可通過調控炎癥反應、免疫應答等發揮多靶點效應。

在分子對接中，虎杖的核心化合物β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚與TP53、PTGS1的結合能均＜-5.0 kJ·mol-1，說明這些核心化合物與受體蛋白的結合能力較強，進一步驗證了富集分析得出的結果。其中，β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗抑郁、抗脫發等多種生物活性，在腎臟、心血管、呼吸系統等多種類疾病中具有較好的功效[15]。大黃酚具有抗腫瘤、抗炎、保護心肌損傷和神經等多種藥理作用[16]。尚未發現毒扁豆次堿在膿毒癥中的應用，有望成為新的潛在活性成分。在靶標方面，IL6是經典的炎癥相關因子，對膿毒癥預后的預測具有較大價值，且可作為新型冠狀病毒肺炎危重癥的臨床指標預警因子[17-18]。VEGFA是調節血管通透性的細胞因子，分為促血管生成和促炎作用的VEGF-A165a和抗血管生成、抗炎和細胞保護作用的VEGF-A165b兩型。但VEGFA在膿毒癥不同階段參考意義不同，目前尚無定論[19]。低氧誘導因子（HIF）是人體對適應低氧環境的關鍵轉錄因子，在急性低氧反應中發揮關鍵作用。膿毒癥早期腸上皮細胞低氧能量障礙是腸功能障礙重要誘因，機體可能通過上調HIF-1α，促進能量代謝，改善膿毒性腸道黏膜屏障損傷[20]。人類腫瘤相關性最高的基因TP53、前列腺素內過氧化物合酶1（PTGS1）在膿毒癥中的作用尚不明確，有望成為潛在靶點。

綜上所述，本研究結果發現，虎杖可能通過β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚等活性成分，作用于TP53、IL6、CASP3、HIF1A、VEGFA等關鍵靶標，發揮對PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK等信號通路的調節作用，進而通過干預炎癥反應、細胞自噬、免疫應答等機制治療膿毒癥。此結果進一步縮小了虎杖治療膿毒癥的關鍵成分、核心靶標與信號通路范圍，初步揭示了虎杖治療膿毒癥的可能作用機制及物質基礎，并在既往研究[8]基礎上為虎杖治療膿毒癥的科學性與可行性提供了有力支持，可為后續虎杖治療膿毒癥的機制研究、臨床應用以及含有虎杖的中藥復方干預膿毒癥治療相關應用研究提供科學參考。本研究尚未進一步開展細胞及動物實驗驗證，今后可在此基礎上深入探討虎杖治療膿毒癥的相關作用機制并拓寬虎杖及含虎杖中藥復方的臨床應用。