建立超高效液相色譜特征圖譜評價燀桃仁飲片質(zhì)量

劉青，肖炯昌，張文芳，高永堅，魏梅，詹若挻，林碧珊

（1.國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東佛山 528305；2.國藥集團(tuán)廣東一方制藥有限公司，廣東佛山 528244；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子，味苦、甘，性平，歸心、肝、大腸經(jīng)，具有活血祛瘀、潤腸通便、止咳平喘的功效，廣泛用于經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕痞塊、肺癰腸癰、跌撲損傷、腸燥便秘、咳嗽氣喘等病證。臨床中，多用其燀制飲片。但目前對燀制后的藥材飲片缺乏有效的質(zhì)量控制和評估的手段，無法對其效果進(jìn)行直接且全面的評價。《中國藥典》中燀桃仁含量測定項主要是檢測苦杏仁苷，而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，若僅僅按照上述方法難以準(zhǔn)確評價燀制效果，因為只對苦杏仁苷一種成分的測定無法評估燀制前后化合物的變化。炮制過程中燀制不徹底，就起不到殺酶保苷（酶為苦杏仁苷酶，苷為苦杏仁苷）的目的，影響藥效的發(fā)揮[1-2]。由于苦杏仁苷酶的水解作用，苦杏仁苷降解生產(chǎn)氫氰酸[3]，常用苦味酸試紙法檢測氰化物的含量[4]。在種子類藥材炮制中，該方法能間接反映苦杏仁苷酶的活性，從而判斷燀制效果，但只能用作定性判斷，主觀性大。故開發(fā)一種直接判斷燀制工藝的有效方法很有必要。本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法，建立燀桃仁飲片特征圖譜測定方法，用于評價燀桃仁飲片的燀制質(zhì)量，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 儀器 H-class超高效液相系統(tǒng)（美國沃特世公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL104萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；超純水儀（美國Milipore公司）；HH-4水浴鍋（常州奧華儀器有限公司）；HN101電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠）。

1.2 藥物與試劑 19批桃仁藥材產(chǎn)地如表1所示，由國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司林碧珊副主任藥師鑒定為薔薇科植物山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.。市售燀桃仁（批號：20191101）購自國藥集團(tuán)馮了性（佛山）藥材飲片有限公司。苦杏仁苷對照品（純度90.7%），購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110820-201607；野黑櫻苷對照品（純度97.0%），購自阿拉丁試劑公司，批號：B2019085；杏仁腈對照品（純度≥98%），購自Chem Faces公司，批號：CFS301903；色氨酸對照品（純度99.9%），購自中國食品藥品檢定研究院，批號：140686-201904；磷酸，購自阿拉丁試劑公司，批號：B1214004；色譜級甲醇，購自美國BCR公司，批號：0212210501；水為超純水；其他試劑均為分析純。

表1 桃仁藥材產(chǎn)地信息表Table 1 Table of information on the habitat of Semen Persicae materials

2 試驗方法

2.1 試驗對象的制備 隨機(jī)選取3批桃仁藥材（批號分別為TR06、TR15、TR216），每批各選取200 g，分為4份，分別用于制備沸水實驗組和熱水對照組的試驗樣品。①熱水對照組：取桃仁藥材50 g，投入10倍量的熱水中，10 min后撈出，冷浸1 min，手工搓去皮，55℃烘干，分別記為CTR06Y1、CTR15Y1、CTR216Y1。②沸水實驗組：取每批桃仁藥材50 g，各3份，投入10倍量的沸水中，分別于5、10、15 min后撈出，冷浸1 min，手工搓去皮，55℃烘干，分別記為CTR06Y2/CTR06Y3/CTR06Y4、CTR15Y2/CTR15Y3/CTR15Y4、CTR216Y2/CTR216Y3/CTR216Y4。取19批桃仁藥材，參照沸水實驗組的制備方法（10 min），制備19批燀桃仁飲片，記為CTRnY5。

2.3 含量測定 按照《中國藥典》2020年版四部通則“0512”中燀桃仁的含量測定項，采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠（柱長100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑1.8μm）為填充劑；以甲醇-水（體積比20∶80）為流動相；檢測波長為

210 nm。理論板數(shù)：苦杏仁苷峰＞3 000。

2.3.2 制備對照品溶液 精密稱取苦杏仁苷對照品，加70%甲醇配制成含苦杏仁苷80μg/mL的溶液，備用。

2.3.3 制備供試品溶液 取燀桃仁飲片樣品粗粉約0.3 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入50 mL石油醚（60～90℃），加熱回流1 h；冷卻后濾過，棄去石油醚液，揮干藥渣中溶劑，放入原錐形瓶中；精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，待冷卻再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足質(zhì)量，搖勻，過濾。精密量取5 mL續(xù)濾液，置于10 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，搖勻即得。

2.3.4 測定方法 對照品及供試品溶液各1μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定。

2.4 特征圖譜 按《中國藥典》2020年版四部通則“0512”測定。

第四，樹立核心價值，銜接具體實踐。一方面，要建立好以治理腐敗存量與增量為核心的反腐價值體系，保障多元價值的內(nèi)在一致性。如政治價值中的民主、代表性、回應(yīng)性，管理價值中的服務(wù)性、效率性、公開性，績效價值中的反思與革新性，不同價值間存在對應(yīng)和銜接，都服務(wù)于減存遏增目標(biāo)。另一方面，在決策鏈上，規(guī)則制定與資源分配以政治價值為主導(dǎo)；在行政鏈上，政策執(zhí)行與資源消耗以管理價值為指導(dǎo)；在評估鏈上，績效評價與跟蹤反饋以績效價值為主導(dǎo)。每一重點領(lǐng)域都應(yīng)合理定位主導(dǎo)價值，以免出現(xiàn)價值矛盾對立。

2.4.1 色譜條件 填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相A：甲醇；流動相B：0.1%磷酸溶液，以表2中的規(guī)定梯度洗脫；柱溫：25℃；檢測波長：210 nm。理論板數(shù)：苦杏仁苷峰＞3 000。

表2 燀桃仁特征圖譜方法梯度洗脫表Table 2 Gradient elution table of characteristic chromatogram method for chan Semen Persicae

2.4.2 制備供試品溶液 取0.3 g燀桃仁飲片樣品于250 mL燒瓶中，加入15 mL水浸泡30 min；再加入35 mL甲醇，待冷卻后稱定質(zhì)量；超聲30 min，冷卻后用70%甲醇補足質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。

2.4.3 測定方法 取對照品與供試品溶液各1μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定。

2.5 特征圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 取燀桃仁飲片，按照“2.4.2”項方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定，進(jìn)樣量為1μL。以苦杏仁苷（峰4）為參照峰，記錄其他共有峰相對保留時間。在精密度考察中，燀桃仁飲片中的色譜峰相對保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜0.3%，相對峰面積RSD均≤2%（n=6），結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 取燀桃仁飲片，按照“2.4.2”項方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項色譜條件，分別在0、2、4、8、18、24、30 h進(jìn)樣。以苦杏仁苷為參照峰，計算相對保留時間。結(jié)果測得各共有峰相對保留時間的RSD≤0.6%，相對峰面積的RSD≤5%（n=7），表明供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性考察 取燀桃仁飲片，按照“2.4.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項色譜條件，考察特征峰相對保留時間的一致性。結(jié)果測得燀桃仁飲片各個特征峰的相對保留時間RSD＜0.3%，說明該方法的重復(fù)性良好。

3 試驗結(jié)果

3.1 性狀 2個實驗組的燀桃仁性狀如圖1所示，沸水或熱水燀制所得的燀桃仁在外觀上無明顯區(qū)別。

圖1 沸水實驗組和熱水對照組的燀桃仁性狀圖Figure 1 Character map of the chan Semen Persicae in the boiling water experimental group and the hot water controlgroup

3.2 含量 對沸水或熱水燀制所得的燀桃仁進(jìn)行了苦杏仁苷的含量檢測，結(jié)果如表3所示。沸水或熱水燀制所得的燀桃仁中苦杏仁苷含量差異不明顯，且燀制前后的苦杏仁苷含量差異也不明顯。因此，不能通過含量的差異用作燀制效果的判斷指標(biāo)。

表3 3批桃仁藥材及燀制品苦杏仁苷含量表Table 3 Content table of amygdalin of 3 batches of Semen Persicae herbs and their chan products（含量/%）

3.3 苦味酸試紙試驗

3.3.1 沸水或熱水燀制的區(qū)別 采用苦味酸試紙檢測桃仁燀制后的苦杏仁苷酶活性，結(jié)果如圖2所示，熱水燀制所得的燀桃仁（CTR216Y1）的苦味酸試紙在熱水保溫前已稍有變色，熱水保溫5 min已完全變色，表明其苦杏仁苷酶活性仍很強(qiáng)。而沸水燀制所得的3批燀桃仁在熱水保溫前無明顯變色，熱水保溫5 min后，沸水燀制5 min和10 min的燀桃仁（CTR216Y2和CTR216Y3）的苦味酸試紙稍有變色，沸水燀制15 min的燀桃仁（CTR216Y4）的苦味酸試紙均無明顯顏色，表明沸水燀制10 min以上的燀桃仁的苦杏仁苷酶活性已基本滅活。市售的燀桃仁（20191101）的酶活性與沸水燀制5 min的燀桃仁（CTR216Y2）相當(dāng)。其余2批桃仁藥材的結(jié)果趨勢一致。

圖2 桃仁燀制后苦味酸試紙試驗結(jié)果Figure 2 Test results of picric acid test strips after the processing of“chan”

3.3.2 苦味酸試紙變化的基本條件 根據(jù)苦味酸試紙反應(yīng)需要加水，因此，推測苦杏仁苷酶解過程需要水的環(huán)境。本研究觀察熱水燀制所得的燀桃仁在不加水條件下苦味酸試紙的變化情況，結(jié)果如圖3所示。不加水組的苦味酸試紙在水浴反應(yīng)30 min后，仍無明顯變化，證實了苦杏仁苷酶解過程需要水參與的這一假設(shè)。

圖3 桃仁燀制后不加水的苦味酸試紙試驗結(jié)果（熱水保溫30 min后）Figure 3 Test result of picric acid test strips without water after the processing of“chan”（after holding hot water for 30 minutes）

3.4 特征圖譜

3.4.1 加水浸泡的影響 根據(jù)苦杏仁苷酶解過程需要水，本研究對特征圖譜供試品處理方法進(jìn)行優(yōu)化，對比了供試品處理過程中加水浸泡的差異。將所得的供試品上機(jī)檢測，特征圖譜如圖4所示。加水浸泡的燀桃仁樣品中，苦杏仁苷色譜峰后有一大峰，通過與對照品定位，初步確定新生成的峰為野黑櫻苷；而未加水浸泡的燀桃仁樣品中野黑櫻苷峰面積小。

圖4 加水浸泡對燀桃仁特征圖譜的影響Figure 4 Effect of soaking with water on the characteristic chromatogram of chan Semen Persicae

3.4.2 加水浸泡時間的影響 結(jié)果如表4。取CTR216Y3批燀桃仁飲片，對加水浸泡時間進(jìn)行考察。隨著浸泡時間的逐步增加，圖譜中苦杏仁苷峰面積的占比逐漸下降，并在浸泡30 min時達(dá)到平臺期。通過計算苦杏仁苷、野黑櫻苷和杏仁腈峰面積的總和，發(fā)現(xiàn)總峰面積差異不大，進(jìn)一步證明這3個成分存在相互轉(zhuǎn)換的關(guān)系。

表4 CTR216Y3批燀挑仁特征圖譜峰面積匯總表Table 4 Summary of peak areas for characteristic chromatogram of CTR216Y3 chan Semen Persicae

3.4.3 燀制效果對特征圖譜的影響 采用浸泡30 min的供試品處理方法，對比了熱水組和沸水組燀桃仁特征圖譜的差異，結(jié)果如圖5所示。熱水燀制所得的燀桃仁的苦杏仁苷主峰已完全降解，且無酶解產(chǎn)物野黑櫻苷和杏仁腈相應(yīng)的色譜峰，只有1個未知峰，猜測是苯甲醛；而沸水燀制所得的燀桃仁的苦杏仁苷主峰稍有下降，可確定部分苦杏仁苷已酶解成野黑櫻苷。

圖5 熱水組和沸水組燀桃仁的特征圖譜Figure 5 Characteristic profiles of the chan Semen Persicae in the hot water group and boiling water group

3.5 多批燀桃仁飲片的質(zhì)量分析

3.5.1 含量 對19批桃仁進(jìn)行燀制處理，具體的炮制工藝如下：取桃仁藥材，置10倍量的沸水中，燀制10 min，放涼，手工脫皮，烘干。對19批燀桃仁進(jìn)行含量檢測，結(jié)果如表5所示。19批桃仁藥材燀制前后苦杏仁苷含量差異不明顯。

表5 19批桃仁藥材燀制前后的苦杏仁苷含量表Table 5 Amygdalin contents of 19 batches of Semen Persicae herbs before and after the processing of“chan” （含量/%）

3.5.2 苦味酸試紙 對19批燀桃仁進(jìn)行苦味酸試紙檢測，并對試紙變色情況進(jìn)行評分，評分結(jié)果如表6所示。19批燀桃仁的評分結(jié)果差異不明顯，波動范圍為3～6分。

表6 19批燀桃仁飲片的苦味酸試紙試驗評分表Table 6 Tablets of scores of picric acid test strips for 19 batches of chan Semen Persicae Decoction Pieces （評分/分）

3.5.3 特征圖譜 對19批燀桃仁進(jìn)行特征圖譜檢測，并計算苦杏仁苷峰面積與總峰面積的比值，結(jié)果如表7所示。19批燀桃仁的苦杏仁苷峰面積與總峰面積的比值變化波動范圍為0.65～0.89。

表7 19批燀桃仁飲片的特征圖譜峰面積匯總表Table 7 Summary tablets of the peak areas of the characteristic chromatogram of the 19 batches of chan Semen Persicae Decoction Pieces

3.5.4 苦味酸試紙評分和特征圖譜的相關(guān)性 對19批燀桃仁的苦杏仁苷峰面積與總峰面積的比值與苦味酸試紙的評分結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6所示。19批燀桃仁的苦杏仁苷峰面積與總峰面積的比值與苦味酸試紙的評分結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，苦杏仁苷峰面積與總峰面積的比值越大，苦味酸試紙的評分結(jié)果越小，則酶活性越低。因此可用該特征圖譜方法替代苦味酸試紙法，用于評價桃仁的燀制效果。

圖6 苦味酸試紙評分和特征圖譜的相關(guān)性Figure 6 Correlation of scores of picric acid test strips and characteristic chromatogram

4 討論

4.1 含量測定結(jié)果 與桃仁燀制工藝相關(guān)的文獻(xiàn)報道多以苦杏仁苷的含量變化衡量燀制效果[5-6]。但根據(jù)《中國藥典》2020年版的苦杏仁苷含量測定方法中規(guī)定用石油醚對苦杏仁苷進(jìn)行回流除去油脂成分后，再用70%甲醇超聲提取苦杏仁苷。采用石油醚這個有機(jī)溶劑，會直接將苦杏仁苷酶滅活，則無法評價燀制的滅酶目的。有文獻(xiàn)報道，苦杏仁苷在炮制過程中，部分溶解、酶解或受熱破壞導(dǎo)致含量降低[7]。也有文獻(xiàn)報道，桃仁生品、燀桃仁和炒桃仁飲片中苦杏仁苷含量無顯著性差異[8]。本研究制備的19批燀桃仁，苦杏仁苷的含量在炮制前后差異不大，與文獻(xiàn)研究[8]報道的基本一致。

4.2 苦味酸試紙結(jié)果 按照苦味酸試紙的變色情況由淺至深，可反映出氫氰酸的含量由少至多，能定性地判斷出各樣品中苦杏仁苷酶的活性[9]。但因只能肉眼觀察試紙的顏色變化，憑借個人主觀感覺對顏色進(jìn)行打分，且無法反映苦杏仁苷的含量變化情況，故該檢測方法存在粗糙、無法定量的劣勢。

4.3 特征圖譜結(jié)果 關(guān)于加水浸泡的供試品處理過程：有研究指出，苦杏仁苷酶的最佳反應(yīng)條件為略酸的緩沖液體系，且反應(yīng)溫度為50℃[10]。故本研究在50℃水浴下進(jìn)行苦味酸試紙試驗。同時，本研究還確定了苦杏仁苷酶反應(yīng)條件需要水的參與，若樣品中不加入水，即使樣品中的苦杏仁苷酶活性再大，也無氫氰酸的產(chǎn)生，苦味酸試紙也不發(fā)生變色反應(yīng)（如圖2所示）。因此，本研究在特征圖譜供試品處理過程中增加了加水浸泡的步驟，再檢測苦杏仁苷酶解反應(yīng)后的底物和新生成的物質(zhì)，來判斷飲片中的苦杏仁苷酶在炮制過程中的破壞程度。高家鑒等[11]曾提出，為了判斷不同炮制過程對苦杏仁中苦杏仁苷酶的破壞效果，可將供試品在45℃酶解1 h后，再檢測底物即苦杏仁苷的含量；本研究首次將此方法應(yīng)用于特征圖譜檢測，并同時反映苦杏仁苷及其降解產(chǎn)物的變化情況。關(guān)于反映苦杏仁苷降解過程：苦杏仁苷酶將苦杏仁苷降解為野黑櫻苷，櫻葉酶將野黑櫻苷進(jìn)一步水解成杏仁腈，杏仁腈又易分解成氫氰酸和苯甲醛[12]。郭咪咪等曾報道了一種HPLC方法可同時檢測苦杏仁苷與野黑櫻苷[13]；而本研究建立的特征圖譜方法，可同時反映苦杏仁苷、野黑櫻苷和杏仁腈的變化情況，更顯全面、直觀。本研究計算了19批燀桃仁中苦杏仁苷峰面積與苦杏仁苷、野黑櫻苷、杏仁腈三者峰面積之和的比值的變化情況，結(jié)果顯示其波動范圍為0.65～0.89，與張曉男等[5]報道的“苦杏仁苷色譜峰在HPLC指紋圖譜特征峰峰面積之和中約占60%”相一致。本研究結(jié)果還顯示，19批燀桃仁的苦杏仁苷峰面積與總峰面積之比與苦味酸試紙的評分結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。因此，可對燀桃仁飲片進(jìn)行UPLC分析，其特征圖譜能體現(xiàn)燀制飲片中苦杏仁苷酶的活性，進(jìn)而評價燀制工藝。

綜上所述，本實驗建立的燀桃仁特征圖譜方法簡便、快速、穩(wěn)定，可用于評價桃仁藥材的燀制效果，對全面系統(tǒng)地評價和控制桃仁及其炮制品飲片的質(zhì)量具有一定的意義。