COX-2和Ki-67表達與下咽癌臨床病理參數的關系分析

劉 晨 劉 穩

下咽鱗狀細胞癌發生率約占頭頸部鱗狀細胞癌的3%～5%[1]，多發生在梨狀窩，其次為咽后壁，環后區較少，是一種相對少見的惡性腫瘤，多隱匿起病，明確診斷時多已為Ⅲ～Ⅳ期患者，且淋巴轉移與遠處轉移率遠高于其他頭頸部惡性腫瘤[2-3]。盡管隨著醫學的進步，下咽鱗狀細胞癌的治療上有一定的進展，但因其發病隱匿、惡性程度高、易復發、易轉移等特點，下咽鱗癌在頭頸部惡性腫瘤中預后極差，5年生存率在25%～53%之間[4-5]。因此研究下咽癌的發病機理及尋找相關特異性分子標志物并明確新的治療靶點，在改善下咽癌診治策略，提高患者生存率方面具有重要意義。

環氧合酶(COX)是花生四烯酸轉化為前列腺素的限速酶。COX有兩種同工酶COX-1和COX-2。COX-2由花生四烯酸轉化而成，研究證實其與多種腫瘤的發生、發展以及侵襲和轉移有密切關系[6]。

頭頸部腫瘤發病過程中，細胞增殖周期起到非常重要的作用。Ki-67抗原是1983年由Gerdes等發現的在增殖細胞中表達的核抗原，是目前公認的細胞核增值標志物[7]。有研究表明，Ki67的表達能可靠迅速地反映多種惡性腫瘤增殖率，與其發展、轉移等生物學行為有關[8-9]。

本研究采用免疫組織化學方法和Western-blot對下咽鱗癌組織進行COX-2和Ki-67檢測，分析2種標志蛋白的表達與下咽鱗癌臨床病理學特征及生物學行為的相關性，初步探討COX-2和Ki-67作為評價下咽鱗癌發生發展中生物學行為的標志蛋白的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究納入徐州醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉科2013年1月至2015年6月的下咽癌病例資料及手術標本共36例。所有腫瘤組織均經病理學確診為鱗狀細胞癌，并且術前均未行放療、化療。其中包括高分化癌32例，低分化癌4例，臨床分期：T1、T2期共15例，T3、T4期共21例，有淋巴結轉移23例，無淋巴結轉移13例(有無淋巴結轉移根據術后病理結果而定)。所有標本均經患者知情同意后手術切除獲得，標本獲取后分兩部分保存：①經10%甲醛固定、常規石蠟包埋，4 μm厚度連續切片；②液氮凍存。

1.2 方法及試劑

1.2.1 免疫組織化學 采用免疫組化SP法。特異性一抗為兔抗人COX-2單克隆抗體(北京中杉金橋ZA-0515)和鼠抗人Ki-67單克隆抗體(北京中杉金橋TA500265)、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。實驗過程嚴格按說明書操作。標本均經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，做成5 μm厚的組織切片,常規脫蠟水化，PBS沖洗3×5 min,置10 mmol檸檬酸緩沖液,用微波處理修復抗原、蒸餾水PBS各沖洗3×5 min。每張切片滴加50 μl第一抗體4 ℃ 孵育過夜，PBS沖洗3×5 min后甩去PBS液，每張切片滴加50 μl 工作濃度為1∶100 的生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3×5 min后甩去PBS液，DAB顯色、蘇木精復染、脫水透明封片。PBS緩沖液代替一抗作陰性，用已知COX-2和Ki-67陽性的肺癌標本切片為陽性對照，以PBS液代替一抗為陰性對照。

免疫組化染色切片在高倍顯微鏡(200×)下觀察，隨機選擇5個視野，以腫瘤細胞內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，計算每個視野COX-2和Ki-67陽性細胞率，取平均值作為該標本的陽性細胞率。根據顯色強度和范圍，COX-2和Ki-67表達分為陰性(-)：<10%；弱陽性(+)：10%～50%之間；強陽性(++)：>50%。

1.2.2 Western-blot檢測COX-2 將液氮中凍存的組織標本取出稱重，每100 mg加入400 μl蛋白裂解液，置于勻漿器中反復研磨組織，使組織充分勻漿化，冰上充分裂解30 min，12000 r/min離心收集上清液，用BCA法測上清蛋白濃度。將蛋白置于12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉膜1.2 h,加入COX-2兔抗人多克隆抗體(1∶500)及β-actin小鼠抗人單克隆抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜漂洗，加二抗(1∶2000)室溫孵育1 h滴加發光試劑暗室曝光顯示條帶。

1.3 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統計學處理，統計學處理采用卡方檢驗和Fisher確切概率法。檢驗標準P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學方法檢測下咽癌組織中COX-2 和Ki-67蛋白的表達情況

2.1.1 COX-2和Ki-67在下咽鱗癌組織中高表達 COX-2在下咽鱗癌組織中，陽性細胞總表達率為77.8%，主要位于癌細胞浸潤灶、下咽癌角化珠和壞死灶周圍,棕黃色陽性顆粒彌漫分布于癌細胞的胞質或沿核膜周邊呈線狀分布,而且血管內皮細胞的胞質也有染色(表1)。Ki-67陽性總表達率為83.3%，陽性染色主要定位于下咽癌腫瘤細胞核，為棕黃色顆粒，呈彌漫性分布(表1)。

表1 COX-2表達和Ki-67表達情況比較(例，%)

2.1.2 不同臨床分期下咽癌組織中COX-2和Ki-67的表達 在不同臨床分期下咽鱗狀細胞癌中，COX-2和Ki-67陽性率有統計學差異。與T1、T2期下咽鱗狀細胞癌比較，T3、T4期癌組織中COX-2和Ki-67陽性率均明顯增高，且有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同臨床分期下咽癌組織中COX-2和Ki-67的表達(例，%)

2.1.3 COX-2和Ki-67表達與淋巴結轉移的關系 COX-2和Ki-67陽性率與下咽鱗癌淋巴結轉移有密切關系。有淋巴結轉移的癌組織中COX-2和Ki-67陽性率均明顯高于無淋巴結轉移組織，差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 COX-2和Ki-67表達與淋巴結轉移的關系(例，%)

2.2 Western-blot檢測下咽癌組織中COX-2蛋白表達水平

Western-blot檢測結果顯示：COX-2在下咽癌組織中表達水平明顯高于下咽癌旁正常黏膜組織。兩組比較差異有統計學意義(P<0.001)(圖1、圖2)。

注：圖片取自72例樣本Western-blot中的代表性結果；NC為癌旁正常組織；Ca為癌組織。

圖2 下咽癌和癌旁正常組織中COX-2表達量

3 討論

環氧合酶(COX)是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶，其本質是一種膜結合蛋白，具有兩種異構體形式，即COX-1和COX-2，其中COX-1在大多數組織中表達，并介導用于維持正常生理功能的腎上腺素；而多數組織在正常生理條件下并不能檢測到COX-2的表達，但會因受到如炎癥反應、生長因子、原癌基因和腫瘤促進劑等的刺激而迅速合成[10-11]，包括頭頸部惡性腫瘤等各種癌癥發病過程中將會表達上調[12-13]。COX-2主要通過抑制機體免疫功能 、抑制細胞凋亡,促進腫瘤組織血管形成、增加腫瘤的侵襲能力和促進癌前病變向腫瘤轉化而參與癌的形成[14-15]。

Ki-67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，僅在細胞周期增殖階段釋放，標記著細胞增殖的狀態[7]。有研究認為[8]，Ki-67在頭頸部鱗狀細胞癌的發病過程中能夠作為放療敏感性的預測指標，但不能作為化療敏感性的預測指標。然而現有的研究結論尚不完全統一[16-19]，甚至有些矛盾之處，目前比較公認的是Ki-67的表達表明細胞處于增殖期而不能表明細胞增殖的速度[20-21]。因此進一步研究Ki-67與惡性腫瘤生物學行為之間的關系具有重要意義。

本研究表明：較高T分期的下咽癌或存在淋巴結的轉移時，腫瘤組織中COX-2和Ki-67陽性細胞數增多，陽性率顯著升高。癌組織中COX-2的表達量顯著高于癌旁正常組織，表明COX-2和Ki-67在喉癌發生發展的生物學行為中可能起著重要的作用，可能促進癌組織的生長、增值及轉移，這與二者在其他頭頸部鱗狀細胞癌相關研究中結論一致[22]。

綜上所述，COX-2和Ki-67可能作為下咽鱗狀細胞癌早期診斷及預后判斷的分子指標之一，聯合檢測COX-2和Ki-67可能對判斷下咽鱗癌的進展及預后有一定參考價值。