基于機器視覺技術的紫蘇種子活力快檢指標篩選研究

吳偉鋒 侯浩楠 涂柯玲 寧翠玲 楊成民 董學會 曹海祿 孫群

（1 中國農業大學農學院/中國農業大學中藥材研究中心/農業農村部農作物種子全程技術研究北京創新中心/北京市作物遺傳改良重點實驗室，北京 100193；2 承德恒德本草農業科技有限公司，河北承德 067000；3 中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；4 恒德本草（北京）農業科技有限公司，北京 100070）

紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.）為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，是我國傳統中藥的重要一味，以全草入藥，葉可解表散寒，籽可潤肺平喘，梗可理氣寬中[1]。紫蘇市場需求廣泛，在我國各地均有規模化人工種植。但目前市場上銷售的紫蘇種子多從大田或野外直接采收而來，種子質量難以控制，種子凈度、發芽率、出苗整齊度偏低[2]。從紫蘇種子質量相關的3個現行標準，即中華人民共和國農業行業標準NY/T 2494—2013《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 紫蘇》[3]、中華中醫藥學會團體標準T/CACM 1056.83—2019《中藥材種子種苗 紫蘇種子》[4]和河北省地方標準DB13/T 1320.1—2010《中藥材種子質量標準 第1 部分：紫蘇》[5]來看，這3個文件規定的發芽率標準（≥75%）均遠低于農作物種子的質量標準。種子質量已成為制約紫蘇規范化生產和發展的“瓶頸”。種子作為最基本的農業生產資料，在儲藏的過程中會發生自然老化，隨著老化程度的增加，種子的活力會持續下降，對種子播種后萌發以及田間出苗等會產生極大的影響。傳統檢測種子生活力或活力的方法是進行發芽試驗，測量周期長，對種子具破壞性，而且由于發芽環境及人為操作等因素，結果穩定性不夠理想。種子清選是提升種子質量的重要手段之一，主要按種子的物理特性（如寬度、厚度、長度、比重、臨界懸浮速度、顏色等）除去種子中的夾雜物質，如未成熟的、破碎的以及遭受病蟲害的種子和雜草種子，提升種子的凈度和發芽率。在判斷加工程序的有效性方面，多肉眼判斷凈度，無法快速評判種子的活力。中藥材種業市場的種子質量監管、種子質量提升手段有效性的及時判斷等均需要對種子活力進行快速檢測。

種皮葉綠素含量是作為判定種子成熟度及種子質量的重要指標之一，種子葉綠素含量高，則成熟度低；反之，葉綠素含量低則成熟度相對高。歐洲廣泛采用葉綠素熒光儀對種子葉綠素含量進行快速檢測[6-8]，葉綠素熒光技術的操作原理是當波長650～730nm 的光照在種子表皮上，種子表皮上的葉綠素將以熒光和熱的形式散發能量，通過對種子表皮上葉綠素熒光的檢測，實現種子成熟度或種子活力的快速判別。Jalink等[9]依靠葉綠素熒光含量對種子活力進行分級；Kenanoglu等[10]使用葉綠素熒光技術種子分選機對辣椒種子進行分級。目前光學葉綠素熒光檢測儀便攜易操作，檢測快速，但仍存在成本較高的問題。

機器視覺技術近年來發展迅速，是一種計算機技術和圖像識別處理技術相結合的多領域新型交叉技術[11]，具有計算能力強、價格低、非破壞性和高效率等特點[12]，在農作物種子質量分類、品種鑒別等方面已有廣泛應用[13-16]。Xu等[17]通過機器視覺技術采集提取了黃芪種子的多個顏色特征，其中R 值和G 值與葉綠素含量的決定系數R2達到0.969 和0.965，基于多個特征建立的葉綠素含量預測模型，其R2達到0.940 以上。

基于上述研究進展，本研究利用收集到的大量不同來源、不同加工方式處理后的紫蘇種子，通過機器視覺技術采集種子的尺寸、顏色和紋理等表型指標，通過比較單粒種子各表型指標與活力之間的相關性，以篩選到的指標在不同活力紫蘇種子批間進行比較驗證，確定可以代替葉綠素含量的種子活力快檢指標。

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗以15個批次（來源）紫蘇種子作為試驗材料（表1），其中單粒試驗使用Lot 3 批次紫蘇種子，千粒重為3.134g，發芽率為69.3%。以33份不同加工環節（篩選、比重選、色選處理）的紫蘇種子（Lot 1加工后的3份種子，Lot 2加工后的4份種子，Lot 3 加工后的10 份種子，Lot 12 加工后的6 份種子，Lot 13 加工后的2 份種子，Lot 14 加工后的6 份種子，Lot 15 加工后的2 份種子）為快檢指標驗證樣品。

表1 15個批次的紫蘇種子

1.2 試驗方法

1.2.1 單粒試驗從Lot 3 中選取凈種600 粒，置于Microtek MiCardWizard 掃描儀（上海中晶科技有限公司）上，進行種子掃描，獲得分辨率為300dpi 的圖片，保存為.tif 無損格式。

使用種子表型全自動提取系統（PhenoSeed，南京智農云芯大數據科技有限公司與中國農業大學種子科學與技術研究中心共同研發）進行種子表型指標的提取。尺寸指標包括長（Length，單位mm）、寬（Width，單位mm）、長寬比（L/W Ratio）、投影面積（Area，單位mm2）、周長（Perimeter，單位mm）、圓度（Roundness）；顏色指標包括紅色值（Red，R）、綠色值（Green，G）、藍色值（Blue，B）、色相（Hue，H）、飽和度（Saturation，S）、明度（Value，V）、亮度（Luminosity，L）、從紅色至綠色的范圍（a）、從藍色至黃色的范圍（b）、灰度（Gray）的平均值（mean）及標準差（std）；紋理指標包括Gray、R、G、B 這4個分量下的對比度（Contrast）、相異性（Dissimilarity）、同質性（Homogeneity）、能量（Energy）、自相關（Correlation）、角二階矩（ASM）、熵（Entropy）。

將種子按掃描時的序號放入發芽盒中，25℃光照條件下進行標準發芽試驗，每天檢查種子是否發芽，統計到第8 天。

然后采用Excel 2016、SPSS 21.0 對試驗數據進行統計，分析單粒種子發芽情況與種子表型指標之間的相關性。

1.2.2 群體試驗測定15個批次紫蘇種子的尺寸、顏色、紋理指標，分析種子的表型指標與種子發芽率之間的相關性。

1.2.3 快檢指標的篩選與驗證以33 份不同加工環節處理（篩選、比重選、色選）后的紫蘇種子建立驗證樣品池。采用FluoMini Pro 光學葉綠素熒光（CF）檢測儀檢測其葉綠素含量，補充提取機器視覺指標和發芽率，進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 單粒紫蘇種子活力與機器視覺指標的相關性分析相關性分析表明，多項指標與單粒活力存在相關性，篩選出20個與單粒發芽結果顯著或極顯著相關的指標。由表2 可知，顏色指標的相關系數（紅色值、綠色值、藍色值、從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、色相、飽和度、明度）多高于尺寸指標（長、寬、長寬比、投影面積、圓度）。其中從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、色相、飽和度這幾個指標與活力的相關系數較高，絕對值達到0.437 以上。后續將重點關注這幾個顏色指標。

表2 紫蘇單粒種子表型指標與發芽率相關指標篩選

2.2 不同批次紫蘇種子活力與機器視覺指標的相關性分析以15 份紫蘇種子為材料進行群體試驗，對種子批發芽率和群體表型指標平均值進行相關性分析。結果表明多個顏色指標與發芽率存在顯著相關或極顯著相關，相較于單粒試驗，未篩選到尺寸指標。從表3 可以看出，與單粒發芽試驗相比，顯著或極顯著相關的指標數量減少至10個。其中葉綠素含量與發芽率呈現顯著負相關，相關系數為-0.549。單粒試驗中篩選到的從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、色相、飽和度指標同樣出現在群體試驗結果中，相關系數分別為-0.826、-0.949、0.922、-0.820。除了指標平均值外，雖然從紅色至綠色的范圍標準差、從藍色至黃色的范圍標準差、飽和度標準差與發芽率的相關系數絕對值超過0.549（參考葉綠素與發芽率的相關系數），考慮到檢測的方便性，舍棄不用。后面的驗證試驗將重點驗證從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、色相、飽和度這幾個指標。

表3 15 份紫蘇種子表型指標與發芽率相關指標篩選

2.3 快檢指標篩選以33 份不同加工環節（機器篩選、液體比重選及G、R 值分選）的紫蘇種子進行驗證，獲得與前面相對一致的結果，篩選出22個與發芽率顯著或極顯著相關指標。其中葉綠素含量與發芽率呈極顯著負相關，相關系數為-0.569（表4）。從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、色相、飽和度這幾個指標中色相與發芽率的相關系數降到0.380，不如其余3個指標穩定。從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、飽和度均與發芽率呈極顯著負相關，相關系數分別為-0.596、-0.730、-0.699，雖略低于15 份紫蘇種子中與發芽率的相關系數，但仍均高于葉綠素含量與發芽率之間的相關系數。進一步比較不同加工環節分選得到的不同組別種子間從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、飽和度這3個指標的變異系數，探究其在區分種子發芽率上的有效性，結果表明從紅色至綠色的范圍平均值在不同組別之間變異系數最高，穩定高于不同組別的葉綠素變異系數，因此優先推薦通過檢測從紅色至綠色的范圍平均值進行生產上加工或處理手段的有效性判斷。

表4 33 份紫蘇種子表型指標與發芽率相關指標篩選

3 結論與討論

3.1 單粒試驗發現紫蘇種子活力與顏色指標相關性強進行紫蘇種子單粒發芽試驗的目的是為了將每粒種子的表型指標與其發芽情況對應，通過隨機選取一定數量的紫蘇種子進行試驗，可以得到大量的表型數據和對應的發芽結果，從而對活力快檢指標進行初步篩選。相關性分析表明，20個指標與發芽率存在顯著或極顯著關系，種子的多個尺寸指標包含在其中，但相關系數并不高，多數低于顏色指標。

考慮紫蘇種子快檢指標的篩選精簡性和實用性，為此選擇了相關系數較高的a、b、H、S 值作為初步的篩選指標，后續對15 份不同批次的種子進行數據采集，驗證以上4個指標作為快檢指標的可靠性。

3.2 群體試驗發現紫蘇種子活力與a、b、H、S指標相關性強對15 份種子分別進行機器視覺掃描、葉綠素含量測定以及發芽率測定，并將每份種子的表型指標平均值與發芽率進行相關性分析，最終選取得到10個與發芽率顯著或極顯著相關指標。相較于單粒試驗結果，群體試驗并未篩選到與活力顯著相關的尺寸指標，這表明在同一批次內，紫蘇種子活力與尺寸指標相關聯，但在不同批次之間，種子的尺寸差異更多是遺傳因素所導致，與活力的關系并不顯著。相比之下，顏色指標與活力的相關性較為穩定，其中從紅色至綠色的范圍（a）、從藍色至黃色的范圍（b）、色相（H）、飽和度（S）指標相關系數絕對值均穩定高于0.549（參考葉綠素相關系數）。

3.3 快檢指標篩選除機器視覺技術外，近年來基于光學特性的種子活力快速無損檢測技術也在逐漸興起，包括X 射線技術、近紅外光譜技術、高光譜成像技術等。但這些技術尚處于實驗室研究階段，目前市面上缺少商用的種子活力檢測設備，原因在于光學檢測技術成本普遍較高，并且對于不同品種或批次的種子，往往需要通過光譜數據和發芽試驗建立相應的模型，實際應用較為復雜[18]。本研究首次采用機器視覺技術對紫蘇種子進行快檢指標篩選，在一定程度上，對檢測加工工序是否有效、種子處理是否有效等提供了數據指導，大大降低了檢測成本，實際操作也更為簡便。本研究以各種比重篩選、液體比重選及色選分選的種子作為驗證材料，對從紅色至綠色的范圍、從藍色至黃色的范圍、色相、飽和度作為快檢指標的穩定性和區分度進行比較，擴充了樣本數據池，增加了數據可信性。

通過分析比較不同加工環節的種子進行快檢指標的確定，最終以相關性穩定的從紅色至綠色的范圍（a）、從藍色至黃色的范圍（b）、飽和度（S）作為快檢指標。在紫蘇種子生產、加工、銷售等各個環節，可通過機器視覺技術快速提供種子的a、b、S 值，用于種子質量的快速判定，比較加工工序是否有效，種子處理是否有效等。