組蛋白H3K27M誘發彌漫中線膠質瘤的發病機制

姚晶晶，孟軼婷，李 莉，尹洪芳

表觀遺傳學通過DNA甲基化、染色質組蛋白尾修飾、小RNA (microRNA, miRNA) 等方式，影響特異性轉錄因子與其靶基因結合，引起基因改變[1]。WHO(2016)中樞神經系統提出組蛋白H3K27M突變型的彌漫中線膠質瘤，并認為無論腫瘤的組織學分級，其都應被視為WHO Ⅳ級的高級別膠質瘤。前期研究多認為，組蛋白H3K27M突變是關鍵的致瘤因素，然而腫瘤的自然進程和細胞培養顯示，組蛋白H3K27M突變只是驅動因素[2-3]，其他相關因素成為目前研究熱點。

1 彌漫性中線膠質瘤

WHO(2016)中樞神經系統提出伴H3K27M突變的彌漫中線膠質瘤是一種新的腫瘤類型，這也是WHO首次將基因改變與組織學改變聯合作為腫瘤名稱。彌漫中線膠質瘤主要見于中線部位，包括腦干、丘腦和脊髓，也可見于第三腦室、下丘腦、松果體和小腦。腫瘤細胞以星形細胞分化為主，可以是WHO Ⅱ～Ⅳ級中的任何一種形態；且無論哪種組織學分級，預后均類似于WHO Ⅳ級膠質瘤[4]。雖然H3K27M突變也可見于其他腫瘤，如低級別膠質瘤伴毛細胞樣特征、多形性黃色瘤樣星形細胞瘤、中間分化的松果體實質細胞瘤、室管膜下瘤、節細胞膠質瘤、彌漫性軟腦膜膠質神經元腫瘤，但都不能歸為經典的彌漫中線膠質瘤[5]。

2 組蛋白H3及其突變類型

H3K27是指組蛋白H3上第27位賴氨酸。組蛋白是染色體的基本結構蛋白，DNA纏繞包裹4種核心組蛋白異二聚體組成的八聚體進而形成核小體。4種核心組蛋白分別是H2A、H2B、H3、H4，其中H3又分為2種經典型(H3.1和H3.2)，6種亞型分別是：H3.3、CENP-A(centromere protein A)、H3.X、H3.Y、H3.1T和H3.5[6]。經典型組蛋白構成組蛋白的主體，在DNA復制的S期表達，而組蛋白亞型在整個細胞周期中表達[7]。因此，H3.1和H3.2只能在DNA復制期整合到染色質中；而在非分裂細胞中，H3.3持續存在并替代H3.1及H3.2[8]。H3K27M突變是指H3體細胞突變，導致第27位賴氨酸被甲硫氨酸替代。H3K27M突變包括H3.1K27M、H3.2K27M、H3.3K27M，3種類型均可產生H3K27M蛋白，其中以H3.3K27M突變最常見[9]。

3 組蛋白H3K27甲基化及其相關因素

H3K27尾部可以發生單甲基化(H3K27me1)、雙甲基(H3K27me2)、三甲基(H3K27me3)及乙酰化(H3K27ac)等修飾[6]。不同程度的K27甲基化均由多梳抑制復合物2(polycomb-repressive complex 2, PRC2)催化，它是唯一一個明確的H3K27甲基化轉移酶[10]，也是多梳蛋白家族(polycomb group, PcG)中的一員[11]，與PRC1一起，維持基因抑制[12]。PRC2有3個核心成分：EZH1(enhancer of zeste homolog 1)或EZH2、SUZ12(suppressor of zeste)和EED(embryonic ectoderm development)[13]，其中EZH1和EZH2不能同時存在，兩者互相排斥并相互替代[14]。通過EZH2的SET結構域，將S-腺苷基甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)的甲基轉移到H3K27尾上，實現單、雙、三甲基化[15-16]。在正常細胞中，孤立的EZH1/2催化性SET結構域處在自我抑制狀態。當EED通過其芳香籠與H3K27me3結合后，PRC2變構，EZH2與EED、SUZ12相互作用，降低了EZH2自我抑制作用，轉而增強其組蛋白甲基化轉移酶活性，催化H3K27甲基化，形成正反饋環[14,17]。這種EED讀取，EZH2寫入的“寫入與讀取”機制構成PRC2結合H3K27me2/me3形成廣泛染色體結構域的分子基礎，在每個細胞分裂周期中產生基因抑制作用[14]，調節轉錄抑制[18]。

PRC2催化H3K27甲基化并非穩定的流水線作業。PRC2對于不同甲基化水平的H3K27催化速度不同。PRC2催化H3K27me1和H3K27me2非常高效[19]，而H3K27me2轉變為H3K27me3則需要花費更多的時間[19]。不同甲基化程度的H3K27顯示不同的基因分布及功能。H3K27me1占1個細胞中組蛋白H3總量的5%～10%，富集于激活轉錄基因。H3K27me2比例較大，占組蛋白H3總量的50%～70%，覆蓋于基因間和基因內，阻止不恰當的啟動子和增強子激活[10]。H3K27me3占組蛋白H3總量的5%～10%，能夠壓縮染色質，抑制轉錄[20]、富集的位點和PRC2結合位點重合，主要位于啟動子，其他基因位點則處于低表達量[10]。

4 H3K27M突變的影響

整體H3K27me2/me3水平下降特異性的見于H3K27M突變，少見于H3K27I突變[2]，H3.3G34R/V突變膠質瘤中并未出現H3K27me3減少，故而推測H3K27M突變抑制PRC2催化活性[2, 21]。導致H3K27me3減少或重新分布[8, 22-23]，以及H3K27ac表達增加[2]。

關于H3K27M如何影響PRC2活性，H3K27me3整體表達水平下降的機制尚不清楚。目前有幾種推測：(1)H3K27M競爭結合PRC2，導致其隔離失活。晶體結構研究顯示，H3K27M肽比野生型H3肽對PRC2的親和性高16～20倍[21,24]，使H3K27M突變組蛋白與PRC2強力結合，導致PRC2在異常基因位點沉積、隔離和失活，致使H3K27me3整體水平下降[6]。(2)H3K27M與PRC2結合后導致其效能降低，動態分析研究顯示H3K27M肽和PRC2之間相互作用是動態的，不是靜止不變的。起始階段，PRC2被臨時招募到包含H3K27M染色體上，導致PRC2在異常基因位點沉積，不能作用于正常位點[23]。進入穩定狀態后，H3K27M與PRC2呈互斥狀態，大量PRC2從H3K27M染色體中釋放出來，進行再分布。雖然被H3K27M釋放出來，但PRC2活性受到持續性抑制或者降低[17,23]。其對染色質的搜索時間延長，增加了特定靶點的采樣間隔時間，疊加部分PRC2滯留于異常位點，導致PRC2有效濃度下降，進一步降低H3K27三甲基化率[21]。(3)H3K27影響EZH2自甲基化。PRC2經歷各種共價翻譯后修飾，如磷酸化、類泛素化及甲基化。其中PRC2自甲基化主要靶點為EZH2。EZH2自甲基化能夠增強其組蛋白甲基化轉移酶的活性[18]。EZH2自甲基化能夠促進PRC2變構活性及其與組蛋白H3K27結合。在H3K27M突變的細胞中，EZH2自甲基化消失[14]。體外實驗研究顯示，EZH2甲基化環突變主要影響H3K27me2轉變為H3K27me3，從而H3K27三甲基化水平降低[14]。

5 H3K27M突變后H3K27me3表達變化

在H3K27M突變的腫瘤細胞中，H3K27me3整體表達水平下降，但不同基因位點上，H3K27me3表達程度不同。研究顯示，H3野生型細胞中包含強、弱兩種多梳靶點。弱多梳靶點以孤立或短CPG島(CPG islands, CGIs)和低PRC2/H3K27me3密度為特征。強多梳靶點以簇狀或長CGIs及高PRC2/H3K27me3密度為特征[8]。由于在腫瘤細胞中，組蛋白H3K27M突變僅出現于一側等位基因，突變蛋白僅占總組蛋白H3的一小部分(3.63%～17.61%)[2]。因此在弱多梳靶點，少量的H3K27M摻入已經完全抑制有限的PRC2活性，導致H3K27me3減少、喪失。強多梳靶點可能有更多PRC2結合位點，H3K27M的摻入量不足以減少總體PRC2活性。因此，強多梳靶點H3K27me3水平不會受到明顯影響[8]。除了強弱多梳靶點外，有一些位點H3K27me3表達增加，且與初始的H3K27me3水平無關[8]。研究顯示，野生型H3細胞中不存在該位點，且與H3K27M突變細胞中H3K27me3表達降低或不變的位點相比，這些位點由不同的機制調節，具體機制尚不清楚[8]。

目前，H3K27M突變如何影響PRC2活性，使不同位點H3K27me3富集量呈現出不同的變化，有待于更加深入的分析。

6 H3K27M突變對腫瘤發生的影響

研究表明，H3K27M突變能夠調節神經元前體細胞(neuronal precursor cell, NPC)增殖及分化的基因表達增加，促進細胞的生長，增強前體細胞自我更新和增殖[25]。研究人員建立多種模型分析H3K27M突變誘發腫瘤的機制。推測伴有H3K27M突變的核小體一方面阻礙PRC2對維持細胞未分化狀態的關鍵基因發揮抑制作用，另一方面將PRC2限制在激活細胞分化的基因上，持續抑制該基因的分化激活功能，增加細胞的增殖潛能并降低其分化能力[26]。蛋白質組學分析進一步解釋PRC2的缺失導致組蛋白翻譯后修飾的整體變化原因：(1)轉錄抑制修飾H3K27me3的大幅減少；(2)抑制性標記H3K27me2廣泛分布；(3)其他抑制標記如H3K9me3或H4K20me3的補償性增加；(4)活性染色質標記的顯著增加，包括H3K27ac和H3K36me3[27]。推測PRC2在彌漫中線膠質瘤生長過程中持續發揮作用，整體的PRC2功能是維持腫瘤狀態所必需的[26]。

正常情況下，H3K27me3負責抑制性翻譯后修飾(posttranslational modification, PTM)，調節涉及發育、細胞命運及分化方向的基因[25,28]。H3K27me3主要在抑制性位點，H3K4me3與活性啟動子相關，被H3K27me3和H3K4me3聯合標記的啟動子稱為“二價”啟動子，處于靜止狀態[29]。當H3K27M突變致使H3K27me3表達降低，進而釋放靜止的啟動子，使其激活并上調，導致在細胞發育轉變過程中表達的基因上調[25]。不僅H3K27me3下降對腫瘤發生、發展有影響，H3K27me3在H3K27M突變細胞中保留或富集，也影響腫瘤的發生。在突變細胞中H3K27me3富集于CDKN2A位點及CGIs的相關基因上[8]。p16INK4A(位于CDKN2A位點受INK4A編碼)是一種腫瘤抑制蛋白，在細胞周期中起抑制性作用，保護細胞免受腫瘤介導的轉變。腫瘤激活會誘導其強表達[30]。在H3K27M突變腫瘤中，高水平的H3K27me3位于INK4a啟動子，導致p16INK4A表達降低，降低其在細胞周期中的抑制作用，可能與腫瘤的發生、發展有關[8]。

7 靶向治療方法

針對H3K27M突變引起的一系列改變，靶向藥物試圖從以下幾個方面改善、治療彌漫中線膠質瘤。在H3K27M突變的腫瘤細胞中，組蛋白修飾酶活性不平衡，導致組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases， HDAC)過表達；HDAC抑制劑Panobinosta被納入藥物實驗[31]。這類藥物導致組蛋白尾聚乙酰化，并意外發現H3K27三甲基化表達增加，其緩解了H3K27M對PRC2抑制作用[32]。因此，甲基化/乙酰化平衡的整體調節被視為轉變H3K27M突變引起的級聯反應的新治療方法[33]。另一種恢復H3K27me3的方法是抑制H3K27去甲基化酶KMD6。去甲基化酶抑制劑GSK-J4可以抑制KMD6基因家族成員JMJD3。在體外實驗和原位腦腫瘤模型中，GSK-J4是細胞增殖的有效抑制劑，促進K27M腫瘤細胞凋亡[34]。由于慢性Panobinosta暴露導致腫瘤細胞藥物耐受，而GSK-J4和Panobinostat具有協同增強作用[32,34]。此外，GSK-J4通過恢復H3K27甲基化，間接修飾DNA結構，降低染色質開放程度，防止DNA啟動子和遠端結合位點接近，從而降低涉及DNA損傷修復相關基因的表達[35]。與放療協同作用時，將增強放療對DNA的損傷作用，促進細胞凋亡或死亡[35]。

目前，有關EZH2抑制劑對腫瘤細胞效用的體內外研究結果不統一。體內實驗中，EZH2抑制劑可以顯著抑制腫瘤生長，延長生存期；但在體外實驗中僅能短暫抑制腫瘤細胞增殖[36]。因此，未來還需更多的研究來探討其作為抑制劑的效用。

綜上所述，H3K27M作為一個啟動突變，通過抑制PRC2變構活性、催化效能或自甲基化水平，導致H3K27me3表達降低或者再分布。雖然多數時候H3K27me3表現為抑制作用，但仍有部分位點表達升高，這些變化在腫瘤的發生中起重要作用。H3K27me3在不同位點富集量的改變，只是腫瘤發生的其中一點；H3K27me3與其他因子相互作用，以及在細胞發育不同階段的作用，還需進行更深入的分析。