KCl部分替代NaCl對宣威火腿細菌多樣性的影響

丁習林，楊子江，廖國周，萬大千，孔維成，李 聰，谷大海，普岳紅，葛長榮，王桂瑛,

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南 昆明 650201）

宣威火腿是我國云南省的傳統名特優肉制品[1]，以營養豐富、滋味鮮美、油而不膩、香氣濃郁著稱于世，它的主要特點是：形似琵琶、只大骨小、皮薄肉厚、肥瘦適中，切開斷面香氣濃郁、色澤鮮艷，瘦肉呈鮮紅色或玫瑰色，肥肉呈乳白色，骨頭略顯桃紅，給人以自然協調的美感[2]。宣威獨特的地理氣候造就了火腿腌制、發酵的天然環境。宣威火腿鹽含量一般為9.1%～11.2%[3]，口感偏咸，屬于高鹽肉制品，然而，已有大量研究表明，過量攝入食鹽是目前導致高血壓和心血管疾病等的重要因素[4-6]。因此，嚴重影響消費者健康及火腿產業的發展，成為導致宣威火腿優勢不優、名牌不名、產業不強、效益不大的因素之一。

在火腿加工生產過程中，食鹽能使肉制品脫水，起到抑制肉制品中微生物增殖的作用[7]，還能使火腿中蛋白質發生變性與重組，從而形成穩定的凝膠結構，在一定范圍內改善火腿制品的嫩度與多汁性[8]。因此在低鈉肉制品中，會影響產品的品質，喪失原有風味，并且更容易造成腐敗變質。在肉制品加工過程中使用NaCl的替代品已成為必然的趨勢。NaCl的替代品主要有氯化鉀（KCl）、氯化鎂、氯化鈣、乳酸鉀、抗壞血酸鈣和甘氨酸等[9]，因KCl與NaCl性質相似，目前為止仍然是最常見的鈉鹽替代品之一，雖然KCl被廣泛用于各種肉制品的研究中，但肉制品種類繁多，工藝條件各異，不同替代鹽對產品的作用可能存在一定差異。一項新的建模研究表明，在中國使用鉀鹽替代鈉鹽每年可防止約50 萬人死于心血管疾病[10]。因此，以鉀鹽替代鈉鹽應用于肉制品中有益于人體健康，但KCl的替代量與產品品質之間的關系仍需進一步研究。

以往的研究表明，火腿的特殊風味是由火腿發酵過程中經過一系列復雜的生化反應產生的，包括脂質氧化、美拉德反應和蛋白質降解等[11-12]。隨著火腿的不斷發酵，火腿的理化性質發生變化，從而影響最終產品的品質，這些變化主要依賴于微生物內源酶的催化作用[13-14]。 近年來，火腿中微生物群落的組成和優勢種的鑒定得到了廣泛研究。李平蘭等[15]通過分析宣威火腿成熟產品中主要微生物菌相構成，發現宣威火腿中的優勢菌群主要為葡萄球菌、微球菌和霉菌，耐鹽性的葡萄球菌和微球菌的代謝活動以及火腿表面大量霉菌的生長是宣威火腿獨特風味形成的基礎。Wang Xinghong等[16]對宣威火腿天然微生物的研究發現，酵母是對宣威火腿品質起重要作用的主要微生物。此外，鄒穎玲等[17]基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-變性梯度凝膠電泳技術分析宣威火腿中真菌群落結構，從不同加工年份的宣威火腿中共檢測到27 種真菌，其中假灰綠曲霉（Aspergillus pseudoglaucus）是宣威火腿的優勢菌種，加工3 年宣威火腿表面的真菌群落多樣性最高，加工2 年宣威火腿表面最低；而加工2 年宣威火腿內部真菌群落多樣性最高，加工3 年宣威火腿內部最低。此外，高通量測序技術是表征微生物群落多樣性的有效分子工具，已成功用于測定許多肉制品生產或貯藏過程中微生物種群的變化[18-19]，也具有獨特的優勢，如能在較短時間內識別不可培養微生物[20]。

使用KCl替代NaCl腌制宣威火腿是否影響宣威火腿中的微生物具有重要的研究意義?；诖?，本研究以30%～60% KCl替代NaCl對宣威火腿進行腌制，對不同KCl替代量的宣威火腿細菌多樣性和群落結構進行研究，旨在為低鈉鹽宣威火腿的開發提供理論依據，為全面提升產品品質提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用同批次飼養10 月齡的含烏金豬血統的宣和豬15 頭，統一屠宰后取豬后腿30 條作為原料腿，平均腿質量為（14.77±0.72） kg，于云南省宣威市浦記火腿食品有限公司進行腌制、發酵、成熟。

食鹽（食品級） 云南省鹽業有限公司；KCl（食品級） 連云港科德化工有限公司；DNA提取試劑盒 美國Bio Tek公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設備

GeneAmp?9700 PCR儀 美國ABI公司；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統 美國Promega公司；移液器 德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Gel-Doc2000凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

采用單因素試驗設計，將30 條豬后腿隨機分成5 組，每組6 條。根據國內外干腌肉制品KCl替代NaCl比例的相關研究，最大可接受替代比例 為50%～60%[21-22]，結合已有研究結果設計KCl的替代比例。本研究以100% NaCl為對照，使用KCl分別替代30%、40%、50%和60% NaCl制備宣威火腿。

1.3.2 宣威火腿的加工

火腿的加工按照傳統宣威火腿的加工工藝進行。各組KCl的替代量分別與對應的食鹽混合，腌制時食鹽和鉀鹽的添加量為鮮腿質量的6.5%。宣威火腿的加工參照包媛媛等[23]的方法進行，其工藝流程主要包括修割定型、上鹽腌制、堆碼翻壓、洗曬整形、上掛風干和發酵管理等基本步驟?；鹜鹊募庸ぜ鞍l酵均于云南省宣威市浦記火腿食品有限公司進行。

發酵成熟的宣威火腿經洗霉修割，取各處理組火腿股二頭肌樣品為實驗材料，樣品取出后真空封口，于-80 ℃冰箱保存待分析。宣威火腿的品質測定于云南省畜產品加工工程技術研究中心進行。

1.3.3 宣威火腿微生物多樣性的測定

1.3.3.1 樣品制備

按照KCl替代比例0%、30%、40%、50%、60%的順序，將每組火腿樣品依次對應編號為A、B、C、D、E組，同時按表面（S）和內部（N）進行編號。

表面取樣：在每只火腿三簽點（上、中、下簽）表面均勻選取，將無菌的脫脂棉簽用無菌生理鹽水浸濕后在選取區域擦拭，每個點擦拭30 s，擦拭面積4 cm2，取樣后將棉拭子頭（3 個）剪下立即放入無菌凍存管，液氮速凍，-80 ℃保存。

內部取樣：在每只火腿三簽點，在火腿表面切除0.5 cm厚、邊長4 cm的四方形棄置，然后在此處切割厚度為2 cm的肉塊，取出后在酒精燈上進行灼燒消毒，立即放入無菌凍存管，液氮速凍，-80 ℃保存。

1.3.3.2 微生物多樣性測序

測序流程：樣品DNA提取→設計合成引物接 頭→PCR擴增與產物純化→PCR產物定量與均一化→ 構建MiSeq PE文庫→Illumina測序

1）DNA提取及檢測：使用基因組DNA提取試劑盒對宣威火腿微生物基因組DNA進行提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

2）PCR擴增：以樣品的基因組DNA為模板進行PCR擴增，細菌用16S rRNA的V3～V4區擴增，其引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和805R（5’-GG-ACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）；PCR反應體系和擴增程序為：5×FastPfu緩沖液4 μL、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷酸2 μL、上游引物（5 μmol/L）0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、牛血清白蛋白0.2 μL、模板DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃退火45 s，擴增循環35 次；72 ℃延伸10 min。每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR產物混合后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3）熒光定量：參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

4）MiSeq PE文庫構建：通過PCR將Illumina測序接頭序列添加至目標區域外端；使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物；Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測；氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

5）MiSeq測序：DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；以DNA片段為模板，芯片上固定的堿基序列為引物進行PCR合成，在芯片上合成目標待測DNA片段；變性、退火后，芯片上DNA片段的另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋（bridge）”；PCR擴增，產生DNA簇；DNA擴增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標記的dNTP，每次循環只合成1 個堿基；用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第1輪反應所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3’端黏性，繼續聚合第2個核苷酸；統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列。

1.4 數據處理

微生物多樣性數據分析：MiSeq測序得到的PE Reads首先根據Overlap關系采用Flash軟件進行拼接，同時利用QIIME軟件對序列質量進行質控和過濾[24]，區分樣本后進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU） 聚類分析和物種分類學分析，基于OTU進行多種多樣性指數分析，利用QIIME軟件進行α多樣性分析[25]。OTU的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、樣本聚類分析、箱線圖、熱圖及韋恩圖等使用R軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 不同KCl替代組火腿細菌序列分析

通過MiSeq測序，獲得用于分析不同樣品的序列。運用高通量測序技術檢測不同KCl替代組火腿樣品細菌群落，由表1可知：在不同KCl替代組火腿表面共得到257777 條16S rRNA序列，其中最大序列數為59288 條，最小序列數為45782 條；火腿內部共得到248102 條16S rRNA序列，其中最大序列數為54066 條，最小序列數為44320 條。序列長度大部分分布在400～500 bp，平均長度420 bp，各樣本序列數均在500 條以上，滿足分析要求。

表1 不同KCl替代組火腿中細菌序列統計Table 1 Statistics of bacterial gene sequences from ham with different levels of KCl substitution

2.2 不同KCl替代組火腿OTU分析

OTU是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的統一標志。根據不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。

由表2可知：火腿表面樣品在序列相似度97%基礎上分類出6153 個OTU，門水平47 個、綱水平117 個、目水平323 個、科水平562 個、屬水平1168 個、種水平2259 個；火腿樣品內部分類出5704 個OTU，門水平48 個、綱水平114 個、目水平310 個、科水平546 個、屬水平1140 個、種水平2165 個。除門水平內部略高于表面外，其余分類水平OTU數表面均高于內部。利用韋恩圖研究不同KCl替代組火腿表面和內部細菌群落結構關系，可以直觀表現出不同KCl替代組火腿表面和內部細菌OTU數組成的相似性及其重疊情況。由圖1A可知，A_S、B_S、C_S、D_S和E_S組樣品共有OTU數量171 個，占總序列數的2.78%，其中對照組樣品獨有的OTU數量最高，為2871 個，其次是50% KCl替代組，為947 個，40% KCl替代組771 個，30% KCl替代組190 個，而60% KCl替代組火腿樣品獨有的OTU數量最少，為126 個，說明本研究中對照組火腿樣品表面細菌群落結構最豐富，而60% KCl替代組火腿樣品表面細菌群落結構多樣性最小。對于火腿內部，由圖1B可知，不同處理組火腿樣品共有OTU數量214 個，占總序列數的3.75%，其中，30% KCl替代組火腿樣品獨有的OTU數量最高，為2659 個，50% KCl替代組火腿樣品獨有的OTU數量最少，為176 個，說明30% KCl替代組火腿樣品內部細菌群落結構最豐富，50% KCl替代組火腿樣品內部細菌群落結構多樣性最小。

表2 OTU的分類學信息統計Table 2 Statistics of taxonomic information of OTU

圖1 火腿表面（A）和內部（B）細菌OTU分布韋恩圖Fig. 1 Venn diagrams for bacterial OTU distribution on the surface (A) and inside (B) of ham

2.3 稀釋曲線分析

稀釋曲線是利用各樣本在不同測序深度時的微生物α多樣性指數構建的曲線，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性，它可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。由圖2可知，隨著測序量的擴大，多樣性指數增加的趨勢逐漸變慢，并且最終均達到飽和狀態，說明測序數據量合理，更多的數據量檢測只會產生少量新的OTU。并且每個樣本的覆蓋率均大于99%，這進一步說明實驗的測序量足夠大，可以覆蓋所有樣品中的大多數微生物。

圖2 火腿表面（A）和內部（B）細菌的Shannon-Wiener曲線Fig. 2 Shannon-Wiener curves for bacterial communities on the surface (A) and inside (B) of ham

2.4 基于OTU的α多樣性分析

α多樣性分析能反映微生物群落中物種的豐富度、覆蓋度和多樣性等信息。常用的度量標準有Chao 1指數、Shannon指數、Ace指數、Simpson指數、覆蓋率等。Ace指數、Chao 1指數用于反映群落豐富度，二者越大則群落豐富度越高。Simpson指數和Shannon指數反映菌群多樣性，Shannon指數越大，群落多樣性越高，Simpson指數越大，群落多樣性越低。覆蓋率用于分析樣品的測序覆蓋率，該指數越高越能反映樣本的真實情況。

所有實驗樣品的覆蓋率均為99%，表明本次實驗建立的文庫能夠較準確地反映待測樣品的微生物多樣性情況。由圖3可知，表面樣本中，A組火腿樣本Ace和Chao 1指數均高于其他4 個KCl替代組，說明KCl部分替代后宣威火腿表層的菌群豐度有所降低。C組與B組和E組的Ace指數存在顯著差異（P＜0.05），D組與B組和E組的Chao 1指數存在顯著差異（P＜0.05）。從Shannon指數與Simpson指數均可以看出，A組表面的細菌群落多樣性最高，KCl的替代在一定程度上降低了火腿表面群落的多樣性，但各組間群落多樣性無顯著差異。對于火腿內部樣品，B組的Ace指數、Chao 1指數與Shannon指數均為組間最高，且Simpson指數最低，說明B組樣品內部的菌群豐富度與多樣性較好。同時由圖3B可知，5 組樣本的Ace指數、Chao 1指數、Shannon指數與Simpson指數組間無顯著性差異。

圖3 火腿表面（A）與內部（B）樣本α多樣性指數組間差異檢驗直方圖Fig. 3 Analysis of inter-group differences in α diversity indexes of surface (A) and internal (B) bacterial communities

2.5 不同KCl替代組火腿群落結構及豐度差異性分析

2.5.1 樣本在門水平上的物種分布

根據OTU結果對不同處理組火腿表面樣品中的細菌OTU進行整理，進而研究不同KCl替代量火腿樣本中的細菌菌落組成。由圖4可知，不同處理組火腿表面樣品被檢出的細菌門主要有變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和迷蹤菌門（Elusimicrobia）等。其中，變形菌門和厚壁菌門在不同處理組的樣本中占多數，是優勢菌門，但是二者在不同處理組的相對豐度不同。A（對照組）、B（30%）、C（40%）、D（50%）和E（60%）組樣品中變形菌門相對豐度分別為44.06%、45.45%、72.57%、56.69%和56.54%，而厚壁菌門相對豐度分別為28.28%、37.54%、9.06%、15.44%和24.64%。KCl的替代使變形菌門的相對豐度增加，在40% KCl替代組中最高，對其他處理組影響較小，而厚壁菌門則在40% KCl替代組中最低。由圖5可知，不同處理組火腿內部樣品中被檢出的細菌門主要有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等。相比于表面樣本，內部樣本門水平菌群種類減少，但變形菌門和厚壁菌門仍然是不同處理組樣本中相對豐度較高的優勢菌門。變形菌門在A（對照組）、B（30%）、C（40%）、D（50%）和E組（60%）樣品中的相對豐度分別為34.67%、49.97%、55.75%、39.43%和39.04%，與表面菌群結構相似，KCl的替代使變形菌門的相對豐度增加，均在40% KCl替代組中最高。而厚壁菌門的相對豐度分別為42.91%、21.42%、31.36%、52.16%和51.05%。當KCl替代量低于40%，厚壁菌門的相對豐度低于對照組，50%～60% KCl替代組間厚壁菌門無明顯差別。

圖4 各組火腿表面樣本在門水平的菌群分布Fig. 4 Phylum-level distribution of surface bacterial community

圖5 各組火腿內部樣本在門水平的菌群分布Fig. 5 Phylum-level distribution of internal bacterial community

2.5.2 樣本在屬水平上的物種分布

熱圖可以通過顏色的相似性及差異性直觀比較分析不同樣本在各種菌群上的差異。在屬水平上，選擇豐度前20的物種進行熱圖分析，從物種和樣品2 個層面進行聚類。由圖6可知，葡萄球菌屬（Staphylococcus）是火腿中屬水平占比較多的菌群，其次分別為鹽弧菌屬（Salinivibrio）和青枯菌屬（Ralstonia）。但KCl的替代對葡萄球菌屬、鹽弧菌屬和青枯菌屬相對豐度的影響較小。其中，葡萄球菌屬在B組（30%）中占比最高，為58.07%。此外，KCl的替代使鹽弧菌屬的豐度增加，但影響較小。由圖7可知，葡萄球菌屬是火腿內部屬水平占比較多的菌群，葡萄球菌屬在A（對照組）、B（30%）、 C（40%）、D（50%）和E組（60%）樣品中相對豐度分別為28.37%、18.03%、37.09%、36.25%和31.10%。KCl的替代使鹽弧菌屬相對豐度明顯增加。此外，火腿內部其他占比較大的微生物還有沙雷氏菌屬（Serratia）、青枯菌屬等，但KCl部分替代NaCl對沙雷氏菌屬、青枯菌屬無明顯影響。

圖6 火腿表面細菌屬水平群落結構熱圖Fig. 6 Heatmap of bacterial community structure at the genus level on the surface of ham

圖7 火腿內部細菌屬水平群落結構熱圖Fig. 7 Heatmap of bacterial community structure at the genus level inside ham

2.6 樣本組間PCoA

由圖8可知，不同KCl替代組火腿表面PC1和PC2分別解釋了細菌群落46.71%和28.70%的信息，不同替代組火腿內部PC1和PC2分別解釋了細菌群落51.16%和19.67%的信息，無論是火腿表面還是內部，2 個主成分之和均大于70%，表明2 個主成分較好代表了樣品中細菌群落信息。火腿表面和內部各處理組樣品有交叉，說明不同KCl替代組細菌存在較大相似性。

圖8 不同KCl替代組火腿表面（A）和內部（B）細菌PCoA圖Fig. 8 PCoA plots for bacteria communities on the surface (A) and inside (B) of ham with different levels of KCl substitution

3 討論

宣威火腿屬于發酵肉制品，火腿成熟過程中微生物在風味的形成和安全方面發揮著重要作用?；鹜戎形⑸锓N類豐富多樣，不同微生物對宣威火腿品質的影響各異。宣威火腿中主要有細菌、酵母菌、霉菌等多種微生物，這些微生物可能來源于豬肉本身、食鹽等發酵劑，或者來源于工具、設備、加工環境[26]，因此不同的鹽分和水分活度等會影響火腿中微生物的種類和含量[13]。本研究結果表明，宣威火腿微生物組成豐富，不同KCl替代組火腿的微生物群落存在一定差異，但葡萄球菌屬仍然是不同KCl替代組火腿的優勢菌群，這與鄒穎玲等[27]的研究結果相一致。葡萄球菌可以促進脂肪和蛋白質降解，從而有助于揮發性風味化合物的生物合成。同時在發酵過程中，葡萄球菌具有硝酸鹽還原酶活性，可將硝酸根還原成亞硝酸根，亞硝酸根會分解產生一氧化氮，再與肌紅蛋白結合生成亞硝基肌紅蛋白，對火腿的顏色也發揮了重要作用[28-30]。

李平蘭等[15]通過采用選擇性培養基對宣威火腿成熟產品中的主要微生物菌相進行分離和計數，結果表明，葡萄球菌、微球菌和霉菌為宣威火腿的優勢菌群。黃艾祥[31]對云南干腌火腿品質特征形成與微生物的作用進行研究，發現葡萄球菌為云腿加工過程中的優勢菌，這與本研究結果較為一致，葡萄球菌均是宣威火腿的優勢菌，且在不同KCl替代組火腿中葡萄球菌屬的相對豐度無顯著差異，說明KCl替代對宣威火腿優勢菌群影響較小，可能是由于KCl與NaCl的化學性質較為相似。KCl的替代使宣威火腿表層和內部變形菌門的相對豐度增加，均在40% KCl替代組中最高，可能是由于KCl代替NaCl可以增加耐鹽菌群的數量[32]。

李欣蔚等[33]對劍門火腿的研究表明，火腿內部的主要微生物為乳酸菌，這與本研究存在一定的差異，可能是由于不同的發酵條件及不同的發酵階段會有不同的優勢菌群。除了優勢菌群外，還含有少量豐度較低的微生物群落，在不同的KCl替代組中均檢測出部分不可分類微生物，這是由于測序結果與數據庫中的序列不匹配或相似度低于閾值，因此這些序列被歸為不可分類的微生物，這些微生物對火腿的作用機理尚不明確，有待進一步研究。

4 結論

KCl部分替代NaCl在一定程度上降低了宣威火腿表層菌群豐度和群落多樣性，對火腿內部菌群豐度和群落多樣性則無顯著影響。各KCl替代組宣威火腿表層和內部樣本在門水平上的優勢菌群為變形菌門和厚壁菌門，KCl的替代使宣威火腿表層和內部變形菌門的相對豐度增加。而在屬水平上，葡萄球菌屬是各替代組宣威火腿表層及內部占比最大的菌群，屬于宣威火腿的優勢菌屬，不同比例KCl替代組宣威火腿葡萄球菌屬的相對豐度無顯著差異。不同組之間微生物群落結構并無明顯區分，因此不同KCl替代組宣威火腿表面和內部細菌存在較大相似性。