不同水解方法對蠶絲蛋白水解多肽含量的影響*

李紅梅，嚴麗君，劉 佳，楊 穎，李春華，金 鑫，王永超

(云南師范大學 職業技術教育學院，云南 昆明 650092)

蠶絲作為“纖維皇后”，其蛋白質含量豐富，可高達98%，是人類最早利用的天然蛋白質之一，蠶絲蛋白主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成[1]。絲素蛋白是沒有生理活性的天然生物大分子之一，約占蠶絲質量的70%～80%，其二級結構以β折疊為主，分子構象穩定，與其它天然高分子相比，優點突出。研究表明絲素蛋白具有生物相容性好、無毒、無污染、無刺激性等特點[2]，由此研制出的人造皮膚、人造血管、人造肌腱和人造骨骼等可被用作不同組織修復的支架材料[3-4]。絲膠蛋白以鱗片狀裹附在絲素外層，形成半透明膠體保護膜，約占蠶絲質量的25%，是一種球狀蛋白，以無規則卷曲為主，分子構象比較松散和無序[5]，用來保護和膠粘絲素。絲膠擁有多種優良特性，如親水性、粘性、抗菌性、抗氧化性等[6-7]。蠶絲的非服飾功能多采用絲素，且制取絲蛋白多以廢繭絲為原料，不含生物活性成分，而對人體有危害的重金屬和其他它有機物常附著在絲膠上，脫膠處理后的絲素蛋白對人體幾乎沒有影響[8]，因此，利用廢繭絲來生產絲素蛋白不僅節約資源，且具有較高的經濟價值。

在蠶絲蛋白的制取工藝中，最重要的是脫膠和水解兩個步驟。常見的脫膠方法有堿法、鹽法、酸法、酶法和高溫煮沸法等。幾種方法各有利弊，其中酶法脫膠效率較低;鹽法脫膠很難除去可溶性鹽，對設備要求較高，產品的光澤度會受到影響;酸堿法脫膠若處理不當常會對生態環境造成污染[9]。相入麗等采用高溫煮沸脫膠法，此法不添加任何化學試劑，對設備要求不高，工藝流程簡單，便于普遍推廣[10]。

絲素肽是絲素蛋白的水解中間產物，其相對分子質量分布在300～20000 μ 范圍內，控制水解程度可以得到不同相對分子質量的絲肽。李圣春等[11]研究表明絲素肽易被頭發吸收從而增加頭發的光澤度和彈性;絲素肽也是天然的保濕劑，可給肌膚提供營養，防止皮膚干燥龜裂;絲素肽能夠抑制黑色素生成，美白嫩膚;絲素肽還可提供人體必需氨基酸，有效控制血糖、膽固醇，在預防自身免疫疾病上發揮重要作用;絲素肽還能用于隱形眼鏡、人工角膜、人造皮膚和人造血管等生物材料的制造。口服毒性試驗結果表明絲素肽作為化妝品原料是安全可靠的，可按任意比例與某些化妝品原料摻合，且可以不用加入乳化劑、分散劑等[12]。鑒于絲素肽的優良特性，其在護膚品、醫藥、食品、生物技術等方面具有廣闊的應用前景。

由于絲素蛋白不溶于水，且很難被酶直接水解，目前常采用堿法和酸法水解絲素蛋白。譚曉慧[13]研究的堿法水解絲素蛋白的最佳水解條件為：加入質量分數為6% NaOH，料液比為 1 g∶100 mL，60 ℃ 水解 3 h。此法采用較低濃度的堿來水解，降低堿對氨基酸的破壞以及減少可溶性鹽，反應時間較短，較為經濟;但堿水解法制取的絲素肽相對分子質量較小，用到透析袋純化時應注意透析袋的大小，以提高絲素肽的產量。酸法水解中的酸主要有鹽酸、硫酸和磷酸，研究表明：鹽酸法反應時間過長，對設備腐蝕性較強，且鹽酸具有強揮發性，對空氣造成嚴重污染，而且脫鹽較難，所以酸法水解主要使用硫酸和磷酸做溶劑。硫酸水解法具有反應條件溫和，產品質量好、產量高等優點，但其耗時較長，能耗較大;袁慧勇等研究得到的硫酸水解的最佳工藝為：加入98% 硫酸，料液比為1∶3，95 ℃ 水解 6 h[14]。李學軍等探索出磷酸水解法水解絲素蛋白的最佳條件為：加入85% 磷酸，料液比為1∶4，95 ℃ 水解 6 h，得到復合氨基酸，該法在制取氨基酸和絲素肽時具有反應條件溫和，時間較短等優點，缺點是水解溫度較高，得到的多數是氨基酸[15]。

鑒于不同的蠶絲蛋白水解方法各有優缺點，有關各水解方法對水解絲素肽的含量影響仍缺乏系統的比較，這對絲素肽的規模化生產造成了一定的影響。因此，本文對不同水解方法對絲素肽含量的影響系統地進行比較研究，可為絲素肽的生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

實驗材料為市場購買的新鮮桑蠶繭。

實驗試劑：NaOH、HCl、H2SO4、H3PO4、無水乙醇和蒸餾水等均為分析純。其它主要試劑有15% 單寧酸、3% 茚三酮乙醇溶液、100 μg/mL 丙氨酸標準溶液、pH為5.4～5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、0.2% 抗壞血酸溶液、活性炭、氧化鈣、混合催化劑(0.2～0.3 g 硫酸鉀和0.2～0.3 g 五水硫酸銅混合均勻)、硼酸、混合指示劑(0.1% 甲基紅乙醇溶液和0.5% 溴甲酚綠乙醇溶液等體積混合)。

電子天平：上海卓精;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海豫康科教儀器設備有限公司;安亭TDL-80-2B低速臺式離心機; UV-2600型紫外-可見分光光度計，日本島津;HR-500半自動凱氏定氮儀，上海華睿儀器有限公司。

1.2 蠶繭脫膠方法

本實驗采用高溫煮沸脫膠法進行脫膠。

家蠶→剪開除雜質→加入蒸餾水煮沸 4 h(多次翻拌，及時補加蒸餾水)→得到絲膠液及不溶物絲素，絲素用蒸餾水洗滌3～4次，低溫烘干備用。

1.3 蠶繭絲素蛋白水解液的制備

1.3.1 H2SO4水解法

稱取 3 g 經熱水脫膠洗凈并干燥好的絲素，以質量比為1∶3的比例與質量分數為98%硫酸混合于燒杯中，在油浴鍋中以 95 ℃ 反應 6 h，中途不時用玻璃棒攪拌。反應結束后取出燒杯進行冷卻，用石灰乳中和至pH值為中性或微酸性，再用活性炭吸附脫色、脫臭，得到的濾液即為硫酸水解法獲得的水解液。

1.3.2 H3PO4水解法

稱取 3 g 經熱水脫膠洗凈并干燥好的絲素，以質量比為1∶4的比例與質量分數為85%磷酸混合于燒杯中，在油浴鍋中以 95 ℃ 反應 6 h，中途不時用玻璃棒攪拌。反應結束后取出燒杯進行冷卻，用石灰乳中和至pH值為中性或微酸性，再用活性炭吸附脫色、脫臭，得到的濾液即為磷酸水解法獲得的水解液。

1.3.3 NaOH水解法

稱取 3 g 經熱水脫膠洗凈并干燥好的絲素，以質量比為1∶100的比例與質量分數為6%NaOH混合于燒杯中，在油浴鍋中以 60 ℃ 反應 3 h，中途不時用玻璃棒攪拌。反應結束后取出燒杯進行冷卻，用鹽酸中和至pH值為中性或微酸性，再用活性炭吸附脫色、脫臭，得到的濾液即為氫氧化鈉水解法獲得的水解液。

1.4 多肽含量的測定

1.4.1 上清液中多肽含量的測定

蛋白質測定常采用凱氏定氮法，通過測出樣品的總含氮量，再乘以蛋白質系數求得蛋白質含量。用單寧酸做蛋白沉淀劑，通過離心作用把樣品中大分子蛋白質與小分子多肽分離，大分子蛋白質被沉淀在下層溶液中，小分子物質留在上清液中。上清液采用茚三酮顯色法，在氨基酸標準曲線上找出相應的游離氨基酸含量。隨后用上清液中總蛋白質含量扣除上清液中游離氨基酸含量，即可獲得上清液中多肽含量。

ρ=N×6.25，

T=ρ-A。

式中：N—樣品的含氮量，%;c—鹽酸標準液的濃度，mol/L;V1—空白滴定消耗的標準鹽酸的體積，mL;V2—樣品消耗滴定消耗的標準鹽酸的體積，mL;0.014—氮的毫摩爾質量，g/mmol;m—樣品的質量，g;6.25為蛋白質系數;ρ為總蛋白質質量濃度，g/100 mL;T為多肽質量濃度，g/100 mL;A為游離氨基酸的質量濃度，g/100 mL。同一樣品測定3次，其結果的算術平均值作為最終結果，最終結果精確到小數點后4位。

1.4.2 上清液中總蛋白質質量濃度的測定

采用凱氏定氮法測總蛋白質質量濃度。

離心：分別抽取三種水解液和蒸餾水各 3.0 mL 于4支 25 mL 離心管中，用 4000 r/min 離心機離心 10 min。隨后吸取 1.0 mL 上清液于 25 mL 比色皿中，加入 3 mL 15%的單寧酸溶液，室溫靜置沉淀 10 min，再次用 4000 r/min 離心機離心 30 min，上清液為后續所需的不同水解方法獲得的離心溶液。

消化：準確抽取上述上清液 2.0 mL 于干燥潔凈的消化管中，并依次加入混合催化劑 0.5 g、10 mL 98% H2SO4，輕輕搖勻，放到消化爐上。打開消化爐使溫度升至 421 ℃，開始計時消化 4 h。關閉消化爐，冷卻至室溫。

蒸餾、吸收與滴定：先用一個空管做空白測試，連續空蒸3個左右，預熱蒸空管。將消解好的樣品空白放入凱氏定氮儀中，關上安全門，等待儀器蒸餾結束，先取出消化管再拿出收集氨氣的錐形瓶，之后用 0.01 mol/L 的鹽酸標準液滴定，當錐形瓶里的液體溶液由藍綠色變為微紅色時即為滴定終點，記錄空白滴定鹽酸標準溶液消耗的體積V1。按照同樣的步驟，依次將消解好的樣品放入凱氏定氮儀中進行蒸餾與吸收，并記錄鹽酸標準溶液消耗的體積V2。

1.4.3 上清液中游離氨基酸質量濃度的測定

茚三酮法測定游離氨基酸質量濃度的原理：游離氨基酸和茚三酮的反應分兩步進行，第一步是氨基酸被氧化，產生CO2、氨和醛，而水和茚三酮則被還原成還原性茚三酮;第二步是生成的還原性茚三酮與另一個水合茚三酮和氨縮合成藍紫色化合物，該化合物顏色的深淺與氨基酸的質量濃度成正比，因此可通過用紫外可見分光光度儀測定 570 nm 下的吸光度值即可測出游離氨基酸的質量濃度。

氨基酸標準曲線的制作：取6支 25 mL 比色管，分別按照表1所示配制溶液。

表1 氨基酸標準溶液預處理

將上述6支比色管加塞密封置于沸水中加熱 20 min，取出后立即用冷水冷卻并搖動，使加熱時形成的紅色被空氣氧化褪色呈現藍紫色。將6份氨基酸標準溶液分別置于 3 cm 比色皿中，另用空白試劑做對照組，在 570 nm 波長下測定標樣顯色溶液吸光度。以丙氨酸標準溶液質量濃度為橫坐標，以對應的丙氨酸標準溶液的吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 氨基酸測定標準曲線

由以上氨基酸標準曲線得到的回歸方程為y=0.023x+0.0599，相關系數R2=0.9955，因此在氨基酸質量濃度為 0～25 μg/mL 范圍內呈現良好的線性關系。

上清液中游離氨基酸質量濃度的測定：準確抽取1.4.2中3種水解方法獲得的離心液各 1.0 mL 于3支 25 mL 比色管中，各管中均加入 2.0 mL 茚三酮溶液、2.0 mL 抗壞血酸溶液和 5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，并加水定容至 25 mL，搖勻，蓋塞。置于沸水浴中加熱 20 min 進行顯色，取下冷卻。按照氨基酸標準溶液測定方法在 570 nm 波長下比色，并在氨基酸標準曲線上查出相應的游離氨基酸質量濃度。

1.5 數據處理

所有試驗均重復3次，用SPSS 26.0軟件分析差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同水解方法制取的蠶絲蛋白水解液多肽質量濃度

不同水解方法制取的蠶絲蛋白水解液中多肽的質量濃度如圖2所示。

圖2 不同水解方法對多肽質量濃度的影響

2.2 分析討論

從SPSS數據統計分析結果可知，3種水解方法的P值均小于0.05，差異極顯著，具有統計學意義。3種水解方法獲得的水解蠶絲液的多肽質量濃度各不相同，其中，H2SO4水解法獲得的多肽質量濃度均值為 0.5976 μg/100 mL，H3PO4水解法得到的多肽質量濃度均值為 0.1866 μg/100 mL，NaOH水解法獲得的多肽質量濃度均值為 0.3786 μg/100 mL。本試驗探索出采用98% H2SO4，以1∶3質量比于 95 ℃ 下反應 6 h 的水解條件是最佳的，獲得的多肽質量濃度最高，其次是6% NaOH，以1∶100質量比于 60 ℃ 反應 3 h，最后是85% H3PO4，以1∶4質量比于 95 ℃ 下反應 6 h 的條件，該法獲得的多肽質量濃度較低。

3 結論

本試驗探索出采用質量分數98% H2SO4，以1∶3質量比于 95 ℃ 下反應 6 h 的水解條件是最佳的，獲得的蠶絲蛋白水解液多肽質量濃度最高。對不同的水解方法獲得的蠶絲蛋白水解液多肽含量進行研究，可為蠶絲蛋白工業化生產提供理論依據。我國蠶繭資源豐富，容易收集，價格低廉，資源豐富，占有一定的優勢;其有效成分在醫藥、保健、護膚及食品工業有廣泛的應用，市場占有率高。最終，我們希望能夠拓寬蠶絲蛋白的應用領域，提升蠶絲產品的附加值，讓蠶絲為人們帶來可觀的經濟效益和社會效益。