高效液相色譜法測定果皮丹中苯甲酸和山梨酸的不確定度評估

梁潔怡，張志舟，梁柳泳，張 飛，舒永紅

(廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學(xué)測量與應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510070)

果皮丹是以各種殘次水果(蘋果、香蕉、草莓、香梨、甜橙、柑橘、山楂、菠蘿、芒果、荔枝、獼猴桃等)為原料，通過現(xiàn)代工藝，加工成攜帶方便、開袋即食的小包裝產(chǎn)品。產(chǎn)品營養(yǎng)豐富，富含維生素、礦物質(zhì)，是聚會、休閑、旅游的佳品，深受廣大群眾喜愛。苯甲酸、山梨酸是食品中常用的防腐劑，具有抗微生物活性效果明顯、價格便宜等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛添加于各種果脯、蜜餞、調(diào)味料、腌制蔬菜、果汁飲料、果酒等食品中[1]。由于它們被人體攝入過量會造成一定傷害[2]，國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014對其使用有明確的限量規(guī)定，果皮丹屬于蜜餞涼果類，其中苯甲酸、山梨酸最大添加量為 0.5 g/kg[3]。因此如何客觀準(zhǔn)確地測量其含量對企業(yè)防腐劑的添加具有指導(dǎo)作用。

測量不確定度是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量評估[4]，不確定度值愈小，表示結(jié)果與被測量的真值愈接近，質(zhì)量越高[5-6]。高效液相色譜法(HPLC)測定苯甲酸、山梨酸的不確定度評定已有許多報道[7-11]，但在給出不確定度報告時，存在或這或那的問題：測量結(jié)果未修約到其末位與不確定度的末位一致、最終報告的擴(kuò)展不確定度多于兩位有效數(shù)字和不確定度數(shù)字修約不規(guī)范等。本研究根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.28-2016第一法，采用液相色譜法對食品果皮丹中苯甲酸和山梨酸進(jìn)行測定[12]，結(jié)合JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[13]和CNAS-GL006: 2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[14]對苯甲酸和山梨酸的測量不確定度進(jìn)行評定，找出影響不確定度的主要因素，合理、規(guī)范地給出擴(kuò)展不確定度表示方式，為實驗室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)，保證檢測結(jié)果的質(zhì)量。

1 實驗部分

1.1 材料

果皮丹購自廣州市某超市，取一定量搗碎，混勻，裝入密閉塑料容器中，備用。

1.2 試劑

苯甲酸對照品(99.96%±0.30%)、山梨酸對照品(99.18%±0.50%)，DR公司;亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(分析純)，乙酸銨、甲酸、甲醇(色譜純)，廣州化學(xué)試劑廠;實驗室用水(一級水)。

1.3 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀，SHIMADZU公司;渦旋振蕩器，IKA?MS 3 basis;KQ2200B超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);離心機(jī)，cense?湘儀TDZS-WS;BSA224S(d=0.1 mg)、BT125D(d=0.01 mg)電子天平，德國賽多利斯公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

分別準(zhǔn)確稱取苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.05002和 0.05042 g(精確至 0.00001 g)，置于 50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，此為 1000 mg/L 苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液;混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液由此儲備液稀釋而成。

1.4.2 樣品測定

稱取 2 g(精確至 0.001 g)試樣，置 50 mL 離心管中，加入水約 25 mL，渦旋混勻，于 50 ℃ 水浴超聲 20 min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液 2 mL和乙酸鋅溶液 2 mL，混勻，于 8000 r/min 離心 5 min，將水相轉(zhuǎn)移至 50 mL 容量瓶中，于殘渣中加水 20 mL，渦旋混勻后超聲 5 min，于 8000 r/min 離心 5 min，將水相轉(zhuǎn)移至同一 50 mL 容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻，取適量上清液過 0.22 μm 濾膜，待液相色譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測試方法和實驗原理，試樣中苯甲酸和山梨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(1)計算：

(1)

式中：X——試樣中待測組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/kg;ρ——試液中待測組分質(zhì)量濃度，mg/L;V——試液定容體積，mL;m——試樣質(zhì)量，g;1000——由mg/kg轉(zhuǎn)換為g/kg的換算因子。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)試驗方法和數(shù)學(xué)模型式(1)可知，果皮丹中苯甲酸和山梨酸含量測定的不確定度主要來源有：① 試液中苯甲酸和山梨酸的測定濃度;② 試樣定容體積;③ 試樣質(zhì)量;④重復(fù)性;⑤ 提取過程對樣品回收率影響。

不確定度來源如圖1所示。

圖1 不確定度來源

2.3 不確定度分量及計算

2.3.1 樣品稱量m帶來的不確定度u(m)

稱取果皮丹樣品 2 g，考慮到稱量分兩次進(jìn)行，則稱量帶來的不確定度如下。

2.3.1.1 示值誤差

BSA224S電子天平校準(zhǔn)證書顯示示值誤差的測量擴(kuò)展不確定度：U=0.0003 g，k=2;則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.1.2 重復(fù)性

校準(zhǔn)證書顯示重復(fù)性偏差為 0.0001 g，此結(jié)果為極差值，根據(jù)JJG 1036-2008《電子天平》重復(fù)性測試至少6次，按6次計，根據(jù)JJF 1059-1999《測量不確定度評定與表示》查得系數(shù)C2為2.53，則由天平重復(fù)性帶來的不確定度為：

2.3.1.3 偏載誤差

校準(zhǔn)證書顯示偏載誤差最大值為+0.0001 g，最小值為 0.0000 g，測試位置為5點(diǎn)，查得系數(shù)C3為2.33，則由天平偏載誤差帶來的不確定度為：

由于稱量時需操作兩次，一次為清零，另一次為讀數(shù)，所以應(yīng)記兩次不確定度，所以由天平稱量帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(m)=

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 使用 50 mL 容量瓶定容樣品溶液產(chǎn)生的不確定度u(V)

1)容量瓶的最大允許誤差

50 mL 容量瓶最大允許誤差為±0.065 mL，按三角分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為

2)重復(fù)充滿液體至容量瓶刻度的變動性

重復(fù)充滿液體至容量瓶刻度的變動性通過10次重復(fù)測量，其變動性標(biāo)準(zhǔn)偏差為

SD50 mL=0.0098 mL。

3)溫度變化帶來的不確定度

容量瓶和溶液溫度與校正時溫度不同引起的體積不確定度為50×2.1×10-4×5=0.053 mL(水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，假定實驗室溫度為25℃)，在95%置信概率下，換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

u2=0.053/1.96=0.027 mL

由以上三項合成得出

則樣品定容體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.3 試液中苯甲酸和山梨酸質(zhì)量濃度ρ引入的不確定度u(ρ)

試液中苯甲酸和山梨酸質(zhì)量濃度ρ的不確定度主要主要有3個來源，一是標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制，二是由標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成系列工作溶液產(chǎn)生的不確定度，三是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來的不確定度。

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制產(chǎn)生的不確定度

用BT125D電子天平(d=0.01 mg)分別準(zhǔn)確稱取苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品 0.05002 g 和 0.05042 g(精確至 0.000 01 g)，置于 50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，此為 1000 mg/L 苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，計算公式為：

式中：ρs——苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，mg/L;w——苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品純度，%;mst——苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量，g;Vst——苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品定容體積，mL。

1)苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品純度w帶來的不確定度

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品純度w苯為99.96%±0.30%，擴(kuò)展不確定度為0.30%(k=2);山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品純度w山為99.18%±0.50%，擴(kuò)展不確定度為0.50%(k=2)。則w苯和w山引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2)苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量帶來的不確定度

(a)BT125D電子天平(d=0.01 mg)的示值誤差：校準(zhǔn)證書顯示示值誤差的測量擴(kuò)展不確定度：U=0.00003 g，k=2;則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(b)重復(fù)性：校準(zhǔn)證書顯示重復(fù)性偏差為 0.00002 g，此結(jié)果為極差值，根據(jù)JJG 1036-2008《電子天平》重復(fù)性測試至少6次，按6次計，根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》查得系數(shù)C2為2.57，則由天平重復(fù)性帶來的不確定度為：

(c)偏載誤差：校準(zhǔn)證書顯示偏載誤差最大值為+0.00004 g，最小值為+0.00002 g，測試位置為5點(diǎn)，查得系數(shù)C3為2.33，則由天平偏載誤差帶來的不確定度為：

由于稱量時需操作兩次，一次為清零，另一次為讀數(shù)，所以應(yīng)記兩次不確定度，所以由天平稱量帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(mst)=

=0.000027 g，

則苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量帶來的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3)苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品定容體積 50 mL 容量瓶帶來的不確定度

根據(jù)2.3.2，苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品定容體積 50 mL 容量瓶帶來的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(Vst)=0.00079。

則配制苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3.2 由標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成系列工作溶液產(chǎn)生的不確定度

以 20 mg/L 苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為例，用 1 mL 移液管移取 1 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液到 50 mL 容量瓶，稀釋到刻度。

1 mL 移液管的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由校準(zhǔn)獲得為 0.0018 mL，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0018，50 mL 容量瓶的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由2.3.2求得為0.00079，故

u(ρ01苯)=0.0027×20=0.054 mg/L，

u(ρ01山)=0.0033×20=0.066 mg/L。

2.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列線性擬合帶來的不確定度

分別取苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液依次注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，測定各組色譜峰面積，結(jié)果見表1。

表1 苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度的峰面積

將表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合得如下直線方程：

S苯=a苯×ρ苯+b苯=34754.4ρ苯-684.53;S山=a山×ρ山+b山=65171.1ρ山-2513.72。

以苯甲酸為例，其中a苯=34754.4，b苯=-684.53;S為色譜峰面積;ρ苯為苯甲酸濃度。對各平行樣品中的苯甲酸含量進(jìn)1次測定，由色譜峰面積通過直線方程求得ρ0苯=24.5 mg/L，則ρ0苯的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：

a=34754.4，

P=1(對ρ進(jìn)行1次測量)，

n=7(每個質(zhì)量濃度進(jìn)行1次測量，共1×7=7次)，

=0.41 mg/L。

同樣可以求得山梨酸測試濃度(ρ0山=7.12 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(ρ0山)=0.21 mg/L，

則測定試液中苯甲酸和山梨酸質(zhì)量濃度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定分別為：

換算成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 樣品重復(fù)性試驗帶來的不確定度u(Frep)

在重復(fù)性條件下，對該樣品進(jìn)行了6次獨(dú)立測量，苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.582、0.570、0.566、0.577、0.571 g/kg 和 0.589 g/kg，其算術(shù)平均值為 0.576 g/kg;山梨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.165、0.163、0.171、0.158、0.166 g/kg 和 0.161 g/kg，其算術(shù)平均值為 0.164 g/kg。

單次測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(w苯i)=s(w苯i)

u(w山i)=s(w山i)

實際樣品檢測時通常做平行雙樣，則算術(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(n=2)：

因此重復(fù)測定帶來的相對不確定度為：

2.3.5 回收率R帶來的不確定度u(R)

由于樣品提取不完全或提取過程導(dǎo)致待測組分的損失或污染等，將使樣品中苯甲酸和山梨酸不能100%進(jìn)入到測定液中，本實驗室在測定果皮丹中苯甲酸和山梨酸含量時，進(jìn)行了6次加標(biāo)回收試驗，測得苯甲酸的回收率為88.0%、88.4%、87.0%、88.6%、90.0%和87.4%，平均值為88.2%;山梨酸的回收率為89.8%、90.2%、91.5%、88.5%、90.4%和89.8%，平均值為90.0%。則回收率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(R)為：

u(R苯)=s(R苯)

u(R山)=s(R山)

換算成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 各不確定度分量的合成

將各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量進(jìn)行匯總，如表2所示。圖2和圖3分別為苯甲酸和山梨酸各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量柱狀圖。

表2 苯甲酸和山梨酸的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

圖2 苯甲酸各不確定度分量圖 圖3 山梨酸各不確定度分量圖

由表2和圖2、圖3可以看出，測試液中苯甲酸和山梨酸質(zhì)量濃度的測定過程引入的不確定度最大，是影響測量結(jié)果不確定度的主要因素;其次是回收率和重復(fù)測定引入的不確定度;樣品稱量和定容體積帶來的不確定度很小，可以忽略不計。

合成各不確定度分量值，得：

則：

u(w苯)=0.024×0.576=0.014 g/kg，

u(w山)=0.038×0.164=0.0062 g/kg。

2.5 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[13]，在95% 置信水平下，取包含因子k=2，果皮丹樣品中苯甲酸和山梨酸的擴(kuò)展不確定度分別為：U苯=2×0.014=0.028 g/kg，U山=2×0.0062=0.0124≈0.013 g/kg。

則果皮丹樣品中苯甲酸和山梨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果表示為：

w苯=(0.576±0.028)g/kg，k=2;

w山=(0.164±0.013)g/kg，k=2。

3 結(jié)論

本研究對樣品稱量、玻璃器皿、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、樣品重復(fù)性測定、加標(biāo)回收、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等因素進(jìn)行綜合考察，在各不確定度分量評定過程中，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度貢獻(xiàn)最大，是實際工作中應(yīng)加以控制的關(guān)鍵點(diǎn);其次是回收率和重復(fù)性測定引入的不確定度。因此，在標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中，盡量使用純度高的標(biāo)準(zhǔn)品，使用計量檢定合格的容量瓶和移液管，準(zhǔn)確配制和移取標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)計工作曲線時應(yīng)使樣品溶液濃度位于工作曲線的中間，適當(dāng)增加標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度點(diǎn)和測定次數(shù)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)盡量達(dá)到0.999以上，都可以減小由標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合所產(chǎn)生的不確定度。同時，在樣品提取過程中，嚴(yán)格控制好條件，防止待測組分提取不完全或污染，降低樣品預(yù)處理過程帶來的不確定度。