鐵還原過程對棲熱腔菌Thermosipho ferrireducens JL129W03T的厭氧發酵代謝影響

陳 瑤，邵宗澤，邱冬華，楊 漸，曾 湘*

(1.自然資源部第三海洋研究所、自然資源部海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005；2.中國地質大學(武漢)、生物地質與環境地質國家重點實驗室，湖北 武漢 430074)

已有研究表明，當培養體系中存在氧化還原電勢相對較高的鐵錳氧化物時，微生物對有機碳源的利用率會提高，推測其主要機制為鐵錳氧化物作為電子受體，為微生物獲得更多能量；鐵錳氧化物亦可作為電子傳遞體，加速微生物胞外電子傳遞[4]。例如，在厚壁菌門中，巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)、貝氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、發酵厭氧桿菌(Anoxybacterfermentans)的培養基中添加無定形水鐵礦或磁鐵礦后，葡萄糖的消耗量顯著提高，并使得H2、CO2、乙酸和丁酸等代謝產物產量明顯增加[5-9]。鐵氧化物是深海熱液環境中豐度較高的礦物，但是鐵還原過程對熱液區典型嗜熱細菌(熱球菌目)的發酵代謝過程的影響及機制卻鮮有報道。

本研究以從印度洋西北部嘉士伯脊深海熱液硫化物中分離到的棲熱腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T為實驗對象，添加四方纖鐵礦(β-FeOOH)后對不同培養時間下的細菌量和發酵代謝產物進行了定量分析，并結合該菌株的基因組數據，分析了其代謝途徑。本研究不僅有助于了解深海熱液環境下，菌株JL129W03對有機碳的利用過程和影響因素，也為該菌株進一步開發獲取及應用生物質能源(H2、乙醇等)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌株

鐵還原棲熱腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T,由本課題組前期分離純化自西北印度洋嘉士伯脊(6.4°N，60.5°E，2 919 m)深海熱液硫化物，保存于中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC 1A14213T)和韓國典型菌種保藏中心(KCTC 15905T)。

1.2 培養基

人工海水：23 g/L NaCl,5.0 g/L MgCl2·6H2O,0.15 g/L CaCl2,0.7 g/L KCl,6.05 g/L (NH4)2SO4,0.05 g/L NaBr,0.01 g/L SrCl2·6H2O；YTG培養基：23 g/L酵母提取物,1 g/L蛋白胨,2.5 g/L 葡萄糖,30 g/L海鹽(Sigma),0.4 g/L哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)，0.001 g刃天青；FRP培養基:1 L人工海水中加入10 g細菌學蛋白胨，6.05 g PIPES，0.001 g刃天青；FRPFO培養基:人工海水中加入10 g/L細菌學蛋白胨,0.5 g/L四方纖鐵礦(β-FeOOH;實驗室配制),6.05 g/L PIPES，0.001 g/L刃天青；所有培養基的pH調節至 7.3。通純氮氣除氧后，于121 ℃，滅菌20 min[10]。培養前，添加還原劑0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽。四方纖鐵礦(β-FeOOH):將0.5 mol/L FeCl3溶液在90 ℃下加熱16 h，所得沉淀物用蒸餾水徹底清洗后中溫干燥成粉末狀態保存[11]。

1.3 細菌計數及代謝產物分析

菌株JL129W03按2%比例接種于FRP及FRPFO培養基中，70 ℃厭氧培養，取樣時間為0、12、36、60、96 h。用注射器吸取厭氧管中的菌液，滴加到血球計數板上，熒光染色(LIVE/DEAD?BacLight Bacterial Viability Kits，Invitrogen，USA)后，在顯微鏡下觀察，計算細胞個數。

乳酸、乙醇、乙酸、丁酸的測定：將培養液用稀H2SO4稀釋至終濃度5 mmol/L，過濾后的濾液用Waters高效液相色譜儀(e2695，Alliance)進行定量分析。高效液相色譜條件：色譜柱 (Aminex HPx87)，進樣10 μL，流動相為 5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃。

CO2、H2的測定：抽取血清瓶中的頂空氣體1 mL，加濾頭過濾后進樣，用氣相色譜儀(Thermo Trace GC ULTRA)進行定量分析。氣相色譜儀條件：TCD檢測器(Porapark Q 2 m×1/8英寸)；進樣口60 ℃，柱溫箱50 ℃，檢測器120 ℃，恒溫模式，燈絲200 ℃，載氣He，流速30 mL/min。檢測H2時載氣為N2，檢測CO2時載氣為He，流速30 mL/min。

1.4 還原糖含量測定

將FRP及FRPFO培養基中的細菌學蛋白胨替換為1%的可溶性淀粉或者1%的羧甲基纖維素后，接種2%的細菌，培養24 h(指數生長期后期)后取樣，測定培養基中還原糖含量。

葡萄糖標準曲線繪制：配置濃度為0.007 8、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL的葡萄糖標準液，取75 μL葡萄糖標準溶液，加入150 μL DNS試劑，加入75 μL純水混勻后，沸水浴10 min后冷卻至室溫，OD540處讀取吸光度值。得到葡萄糖標準曲線方程為：y=1.497 2x+0.089 4(R2=0.998 9)。其中y為吸光度，x為葡萄糖濃度(mg/mL)。

1.5 基因組分析

細菌培養至指數后期或穩定期，提取細菌DNA[12]，利用Illumina-Hiseq平臺(美吉生物)測定細菌的全基因組序列(GenBank/EMBL/DDBJ登錄號為CP071446)。通過COG、KEGG、GO、Pfam等數據庫[13-16]對基因進行功能注釋。同時，利用NCBI 細菌基因組注釋工具PGAP對基因組進行功能基因注釋[17]，利用UniProt網站對氫酶進行分析。

2 結果與討論

2.1 添加β-FeOOH對菌株JL129W03細胞生長的影響

在添加了β -FeOOH的FRPFO培養物中，最大細胞生長量可達2.19×108cells/mL，明顯高于不添加β-FeOOH的FRP培養物(最大細胞生長量僅為3.17×107cells/mL，圖1)。添加β-FeOOH的FRPFO培養物中，此結果說明鐵還原過程對菌株JL129W03的細胞生長有顯著的促進作用。

2.2 添加β-FeOOH對菌株JL129W03發酵代謝產物的影響

菌株JL129W03利用蛋白胨進行發酵代謝的主要代謝產物為乙醇、乙酸、乳酸、丁酸、H2和CO2(圖2)。其中乳酸和丁酸在指數生長期初期(12 h)開始大量積累，乙醇在衰亡期大量積累，H2和CO2在指數生長末期及穩定期大量積累。由圖2可知，與未添加β-FeOOH的對照組相比，添加β-FeOOH后的菌株JL129W03產乙醇的最大產量(57.97 mg/L)明顯高于FRP培養物[32.88 mg/L，圖2(a)]；乳酸的最大產量(99.83 mg/L)低于FRP培養物[130.96 mg/L，圖2(c)]；丁酸的最終產量(32.16 mg/L)顯著低于FRP培養物[119.25 mg/L,圖2(d)]；H2的最大產量(14.12 mmol/L)略低于FRP培養物[14.60 mmol/L,圖2(e)]。而β-FeOOH的添加對乙酸[FRPFO:204.22 mg/L；FRP:203.09 mg/L,圖2(b)]和CO2[FRPFO:1.18 mmol/L；FRP:1.15 mmol/L，圖2(f)]的代謝產量幾乎無影響。

圖1 添加/不添加β-FeOOH時菌株 Thermosipho ferrireducens JL129W03T的細胞生長曲線Fig.1 Growth curves of Thermosipho ferrireducens JL129W03T in FRPFO medium with β-FeOOH or FRP medium without β-FeOOH

圖2 不同培養時間Thermosipho ferrireducens JL129W03T的發酵代謝產物Fig.2 Product of fermentation metabolites in Thermosipho ferrireducens JL129W03T in different culture time

2.3 添加β-FeOOH對菌株JL129W03利用有機物的影響

還原糖是纖維素和淀粉水解的產物，本研究通過檢測還原糖來分析菌株水解淀粉和纖維素的能力。結果表明，在以1%羧甲基纖維素或者1%可溶性淀粉為唯一碳源的FRPFO培養物中的還原糖含量為0.16 mg/L和0.83 mg/L，高于不添加β-FeOOH的FRP培養物中的還原糖含量(0.08 mg/L和0.62 mg/L)。由此可見，加入β-FeOOH后，能促進菌株JL129W03水解可溶性淀粉以及纖維素，提高對有機底物利用率。

2.4 基于基因組的發酵代謝途徑分析和水解酶分析

通過基因組信息分析，菌株JL129W03具有完整的糖酵解途徑，通過糖酵解產生ATP、NADH和丙酮酸，丙酮酸繼續被轉化為乙醇、乙酸、乳酸、丁酸、H2和CO2等代謝產物(圖3)。具體的途徑詳述如下。

圖3 Thermosipho ferrireducens JL129W03T碳代謝途徑(包括發酵途徑和產氫途徑)Fig.3 Thermosipho ferrireducens JL129W03T carbon metabolism pathways including fermentation and hydrogen productionG-6-P為6-磷酸葡萄糖,F-6-P為6-磷酸果糖,F-1,6-P為1，6-二磷酸果糖,G-A-P為磷酸甘油醛,B-P-G為2,3-二磷酸甘油酸,GLK為葡萄糖激酶,G6PL為葡萄糖-6-磷酸異構酶,PFK為6-磷酸果糖激酶,FDA為果糖-1,6-二磷酸醛縮酶,GAP為甘油醛-3-磷酸脫氫酶,TPI為磷酸丙糖異構酶,PGM為葡萄糖磷酸變位酶,NSE為烯醇化酶,PK為丙酮酸激酶,LD為L-乳酸脫氫酶,PFL為丙酮酸甲酸裂解酶,ADH為乙醇脫氫酶,AHP為磷酸轉乙酰酶,ACK為乙酸激酶,THL為硫解酶,PTB為丁酰磷酸轉移酶,BK為丁酸激酶。

2.4.1 產乙醇途徑 菌株JL129W03糖酵解產生丙酮酸后，通過丙酮酸合成酶、鐵氧還蛋白酶、丙酮酸氧化還原酶將丙酮酸脫羧生成的乙醛，經過NADPH依賴型乙醇脫氫酶將產物轉化為乙醇[18]。菌株JL129W03中的 gene1722-1725蛋白與海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的TM0015-0018同系物[19](即丙酮酸合成酶、鐵氧還蛋白酶、丙酮酸氧化還原酶)相似，其能代替丙酮酸脫羧酶的作用，此反應已經在Pyrococcusfuriosus的體外實驗中得到證實[20]。

2.4.2 產乙酸途徑 菌株JL129W03糖酵解產生丙酮酸后，通過丙酮酸甲酸裂解酶形成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A在磷酸乙酰轉移酶和乙酸鹽激酶等酶的作用下生成乙酸。

2.4.3 產乳酸途徑 菌株JL129W03糖酵解產生丙酮酸后，在L-乳酸脫氫酶的作用下生成L-乳酸。

2.4.4 產丁酸途徑 基因組中存在形成丁酸的關鍵酶—丁酰磷酸轉移酶和丁酸激酶，但是缺少從乙酰CoA 到丁酰CoA的中心途徑的關鍵酶基因—二羥基丁酸輔酶A脫氫酶和丁酸輔酶A脫氫酶[21]，推測可能存在具有相同功能的其他酶基因。

2.4.5 產氫途徑 丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(PFOR)產生還原鐵氧還蛋白(Fd)，被[Fe-Fe]氫酶(表1)重新氧化，并生成H2；同時利用NADH中的還原力將氧化態鐵氧化還原蛋白還原。

利用UniProt網站分析發現，菌株JL129W03基因組中主要含有3個編碼氫酶的基因，其類型主要為[Fe-Fe]氫酶，與T.maritima等熱袍菌屬菌株均具有較高的蛋白同源性。與T.maritima的氫酶相比，菌株JL129W03的Catalytic HydA中缺少一個[2Fe-2S] 簇，Diaphorase HydB 中缺少兩個[4Fe-4S]簇(表1，圖3、4)。

表1 Thermosipho ferrireducens JL129W03T的氫酶分析Tab.1 Hydrogenase analysis of Thermosipho ferrireducens JL129W03T

圖4 菌株JL129W03和Thermotoga maritima的氫化酶操縱子元件比較Fig.4 Hydrogenase operons in Thermosipho ferrireducens JL129W03 and Thermotoga maritima綠色表示催化位點；氧化還原活性中心用圓圈表示，其中紅色表示[4Fe-4S]簇，黃色表示[2Fe-2S]簇。

ThermosiphoferrireducensJL129W03T基因組中，與糖類代謝有關的編碼基因共計115個，占6.3%左右，含有編碼半乳聚糖(galactan)的α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase)、屬于糖苷水解酶13家族的α-淀粉胞外酶AmyA和屬于纖維素酶系的內切葡聚糖酶等相關基因。與海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)[22]相比，缺少木聚糖酶、海藻多糖水解酶和果膠水解酶等。

2.5 討論

前人研究認為，發酵型鐵還原菌不能從鐵還原過程中獲得能量，三價鐵化合物主要是作為電子的間接接受體。Lovley等(1988)的研究結果表明，添加Fe(III)后，變形菌門地桿菌GeobactermetallireducensGS-15的細胞產量沒有增加[23]。但也有其他研究表明，鐵還原過程不僅能促進細胞的生長，也促進了發酵代謝產物如H2、乙酸、丁酸和CO2等的積累，厚壁菌門微生物在鐵還原過程中獲得了能量[9]。本研究結果表明，鐵氧化物的添加增加了熱袍菌門菌株JL129W03的最大細胞生長量，這說明Fe(III)還原可以為部分細菌生長提供能量。Fe(III)還原過程還促進了乙醇、乙酸的產生，但丁酸的產量相對降低。我們推測，由于產乙酸途徑相比產丁酸代謝途徑可以產生更多的電子。類似現象在梭菌中也有發現[24]，例如在菌株ClostridiumbifermentansEZ-1的培養中，磁鐵礦和水鐵礦的添加加強了菌株產乙酸代謝途徑，同時減弱了菌株的產丁酸能力，產生了更多的電子用來滿足Fe(Ⅲ)氧化物還原對電子輸出的需求[25]。同時，由于發酵產生的NADPH，更利于 NADPH 依賴型乙醇脫氫酶(NADPH-dependent primary alcohol dehydrogenase)的活性，利于乙醇的增加[18-19]。在本研究中，鐵氧化物的添加，促進了菌株JL129W03的發酵代謝，產生了更多的NADPH和鐵還原蛋白，促進了NADPH依賴型乙醇脫氫酶的活性，因此增加了乙醇的產生。

鐵還原棲熱腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T與海棲熱袍菌碳代謝中心途徑和主要發酵途徑相似[26]，菌株JL129W03的產氫途徑推測是[Fe-Fe]氫酶將還原型的鐵氧還蛋白的電子傳遞到質子產生H2或者它同時利用NADH中的還原力產氫，通過與其他發酵途徑競爭NADH達到高產H2的效果。Schr?der等(1994)發現，在熱袍菌門中，Thermotoganeapolitana、Petrotogamiotherma、Thermosiphoafricanus、Thermotogaelfii和Fervidobacteriumpennavorans的H2最大產量分別約為25%～30%、11%、13%、22%和18%[1]。T.maritima的H2最大產量約為7 mmol/L[27]。本研究中，菌株JL129W03的最大H2產量分別為31.7% (FRPFO:14.12 mmol/L)和32.8% (FRP:14.60 mmol/L)，其H2產量均高于目前所報道的同門其他菌株，表明菌株JL129W03在產氫方面具有較大的應用前景。Thermotogahypogea能代謝產生1 mmol/L乙醇[28]；Fervidobacteriumnodosum[29]和Fervidobacteriumgondwanense[30]分別能代謝產生2.3 mmol/L和2 mmol/L的乙醇。本研究中，菌株JL129W03的乙醇產量分別為1.24 mmol/L (FRPFO:57.97 mg/L)和0.71 mmol/L (FRP:32.88 mg/L)，其乙醇產量與目前所發表的菌株產量相似；Fe(Ⅲ)氧化物的添加可以明顯提高其H2和乙醇的產量，為其潛在的應用奠定了基礎。

3 結論

本研究利用細胞計數、液相色譜及氣相色譜對添加四方纖鐵礦(β-FeOOH)后，不同培養時間下菌株JL129W03的細胞生長情況和代謝產物進行了定量分析，并利用基因組信息對其碳代謝中心途徑和主要發酵途徑進行分析。結果表明，菌株JL129W03主要發酵代謝產物為乙醇、乙酸、乳酸、丁酸、H2和CO2。菌株JL129W03經糖酵解產生丙酮酸后，丙酮酸脫羧后生成乙醛再經過NADPH依賴型乙醇脫氫酶將產物轉化為乙醇；通過鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸乙酰轉移酶和乙酸鹽激酶生成乙酸；通過乳酸脫氫酶形成乳酸；[Fe-Fe]型氫酶將還原鐵氧還蛋白重新氧化生成H2。β-FeOOH的存在導致了菌株JL129W03更多的電子需求，能促進細胞的生長及底物的利用率，促進乙醇產生(累積產量提高76%)，抑制丁酸的產生(累積產量降低73%)；對羧甲基纖維和可溶性淀粉的利用率分別提高100%和34%；產生了更多的NADPH，促進了NADPH依賴型乙醇脫氫酶的活性，從而增加了乙醇的產生。本研究對了解鐵還原棲熱腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T的生理代謝特點和進一步應用開發清潔能源(H2、乙醇等)奠定了基礎。

致謝：感謝中國大洋38航次及“向陽紅”9號、“蛟龍號”全體科考隊員協助獲取深海樣品。