嗎替麥考酚酯對阿爾茨海默病大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3表達的影響

宋皓

（山西醫科大學晉祠學院，山西太原 030025）

阿爾茨海默病屬于常見神經退行性的疾病，其臨床特征主要為漸進性認知功能出現障礙、出現行為損害。有報道結果顯示，Aβ蛋白的沉積可誘導腦內小膠質細胞、星形膠質細胞的激活，并能參與體內的免疫應答，分泌大量炎性因子，例如白介素6、干擾素，從而影響神經炎性的反應，致使阿爾茨海默病發展[1]。目前，世界各國的醫療工作者和有關專家已就這種疾病的致病機理以及治療方法等進行了研究，并取得了很多新的進展。然而，由于大腦的復雜性，當前還未找到一種理想的治療方法，盡管有100多種潛在治療阿爾茨海默癥的藥物參與了臨床試驗，但最終保留下來的公認安全、有效的治療藥物卻僅有三四種[2]。而嗎替麥考酚酯就是其中之一，它是一種免疫抑制劑，是一種前體藥物，其進入人體之后水解成霉酚酸而產生免疫抑制作用。在細胞內將受損細胞器降解的自噬行為為細胞的生存提供物質及能量。有報道顯示，阿爾茨海默病特點之一為自噬活性的降低，相關研究明確，Beclin-1蛋白及LC3在自噬通路中分別發揮著誘導自噬的啟動和促進自噬小體成熟的作用[3]。Beclin-1與LC3兩種蛋白均在阿爾茨海默病的患者腦內呈現低表達。本文主要通過SD雄性大鼠制作的阿爾茨海默病大鼠模型，研究分析嗎替麥考酚酯對其海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3表達的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物、實驗器械

嗎替麥考酚酯（國藥準字H20059282，0.5 g），重慶萊美藥業股份有限公司；多奈哌齊（國藥準字號H20030472，5 mg），江蘇豪森藥業集團有限公司。

51600型大鼠的腦立體定位儀，上海玉研科學儀器有限公司；STELLARIS 5共聚焦顯微鏡，德國Leica公司；JS-2000凝膠成像儀，上海培清科技有限公司。

1.2 實驗動物

選取質量為（250±30）g的SD雄性大鼠，來源于北京軍事醫學科學院的實驗動物中心。所有選取的大鼠均在溫度（24±4）℃、濕度（39±9）%的環境下適應性飼養1周以后進行實驗。

1.3 制作模型方法、分組方法及用藥

（1）模型的制作。應用戊巴比妥鈉腹腔的方法對大鼠進行麻醉，在大鼠的腦立體定位儀上固定其頭部，切開皮膚，露出其顱骨，對前顱進行定位，并在前顱后面1.5 mm、旁開0.8 mm的位置定位側腦室，顱骨鉆孔，骨窗的直徑大約為2 mm，通過微量注射器注射2 μL的Aβ25-35，緩慢進針，保持4 mm的深度并回退1 mm，緩慢注射5min且需留針5 min，退針后縫合皮膚，用碘伏消毒[4]。1組于側腦室注射2 μL的生理鹽水，其他3組注射2μL的Aβ25-35，注射方式同前，存活下來的大鼠進行實驗。

（2）實驗分組及用藥。實驗分為1組、2組、3組、4組。1組（對照組）：每天注射0.9%的等量生理鹽水（無菌），40 d不間斷注射；2組（模型組）、3組（給藥組）以及4組（陽性對照組）：每日注射一次標準為120 g/kg的D-半乳糖。其中，2組每天給予0.9%的等量生理鹽水（無菌），3組每天一次嗎替麥考酚酯，劑量為0.2 g/次，4組為多奈哌齊（陽性對照）組。每組10只，所有大鼠在清醒之后給藥，均使用對應藥物作灌胃處理，且持續給藥4周。

1.4 識別實驗

用不透明的檢測箱對大鼠進行3個階段（適應、訓練、檢測）訓練[5]。適應階段：檢測箱內無任何物體，將大鼠放置箱內活動5 min，再將大鼠取出；訓練階段：將2個相同物體放于檢測箱內，并將大鼠背對物體放置，讓大鼠對2個物體熟悉，10 min后將大鼠取出；檢測階段：原檢測箱內2個相同物體取出1個，并重新放置1個形狀不同新物體，將大鼠放置箱內活動5 min，記錄大鼠舔咬、蹭擦新物體的時間或者鼻子挨近新物體1 cm內的范圍，即屬于大鼠對新、舊物體探索的時間。3個階段的訓練均需間隔24 h，且每次、每只大鼠放置檢測箱之后，均用乙醇擦拭檢測箱及所有物體。用識別指數（DI）評價大鼠對不同物體探索的時間，按公式（1）計算。

式中：N為大鼠對新物體探索消耗的時間，s；F為大鼠對熟悉物體探索消耗的時間，s。

1.5 水迷宮實驗

注入溫度為（23±3）℃清水于水迷宮桶內，水面高過平臺，且高出2 cm，加入藍墨水。逃避潛伏期：等距離將水桶上緣分為4個點，大鼠面對池壁從任意1個點入水，游到平臺且站到平臺時間。每只大鼠每天記錄1次逃避潛伏期，連續記錄5 d，同時記錄5 d游泳距離，取平均值。第6天取消平臺，大鼠從任意1個點入水，記錄大鼠1 min之內到原平臺次數，檢測大鼠記憶[6]。

1.6 HE染色

行為學實驗后，將每組大鼠深度麻醉，開胸暴露心臟，從左心室刺入主動脈，先快速灌注磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，4 ℃），再灌注4%多聚甲醛溶液（溶解于PBS，4 ℃）固定。斷頭取腦，將腦浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定保存（4 ℃），用石蠟包埋海馬，制成5 μm厚度切片，后經HE染色，顯微鏡下觀察拍照。從每個大腦中選擇4～5片進行分析，每個切片同一個平面范圍內腦組織神經元受損情況重復分析兩次[7]。

1.7 蛋白質印跡法檢測

運用蛋白質印跡法對提取自海馬區的蛋白進行檢測。通過制膠、電泳、封閉、一抗孵育過夜，LC3及Beclin-1以及內參β-actin一抗濃度根據說明書稀釋。二抗孵育1 h之后，將膜放在凝膠成像儀，加發光劑，將顯影曝光，以Image J分析Beclin-1、LC3蛋白的表達情況。

1.8 統計學方法

本研究數據運用SPSS 19.0統計分析，計量資料以±s表示，組內均數用one-way ANOVA，組間均數用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組識別指數、穿環次數、游泳距離、潛伏期的對比

由表1可知，與第1組相比較，第2組識別指數及穿環次數均顯著下降，潛伏期及游泳距離顯著增加，且P均＜0.05；與第2組相比較，第3組、第4組識別指數及穿環次數均顯著增加，潛伏期及游泳距離顯著下降，且P均＜0.05。

表1 各組識別實驗指數、穿環次數、游泳距離、潛伏期的對比（±s）

表1 各組識別實驗指數、穿環次數、游泳距離、潛伏期的對比（±s）

注：“*”表示與第1組相比，P＜0.05；“#”表示與第2組相比，P＜0.05。下同。

組別 識別指數/%穿環次數/次游泳距離/c m 潛伏期/s第1組（n=1 0） 5 3.2 2±5.4 9 1 1.2 3±3.5 2 2 3.3 7±5.6 8 3 4.3 3±5.4 2第2組（n=1 0） 1 3.5 4±9.0 2*4.6 8±1.6 7*7 3.6 5±9.6 7*8 7.6 5±6.3 2*第3組（n=1 0） 3 1.6 5±5.6 8#7.9 8±1.2 9#5 3.4 2±5.4 4#6 4.5 2±4.5 2#第4組（n=1 0） 3 3.9 6±6.9 8#8.0 3±1.7 4#5 0.6 8±5.6 4#4 4.6 8±3.7 1#

2.2 各組大鼠凋亡小腦神經細胞的情況

如圖1所示，本文對各組動物海馬區進行了組織形態學觀察，發現與第1組相比，第2組大鼠海馬CA1區細胞帶排列紊亂、稀疏，出現神經元丟失、可見核固縮或溶解、細胞空泡以及胞體不規則等形態學改變。統計學數據分析顯示，與第1組相比，第2組大鼠CA1區椎體細胞凋亡增多，神經元密度顯著降低。與第2組相比，第3組大鼠神經元細胞排列整齊，邊界清晰，神經元細胞數量顯著增多；第4組神經元細胞排列更加整齊，凋亡的細胞與3組無明顯差異。因此可以得出嗎替麥考酚酯能夠有效阻止神經細胞的凋亡。

圖1 各組大鼠海馬錐體神經元HE染色（Bar=50 μm）

2.3 各組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達

由表2可知，與第1組相比較，第2組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達顯著下降（P＜0.05）；與第2組相比較，第3組、第4組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達顯著上升（P＜0.05）。表明嗎替麥考酚酯能夠有效抑制小膠質細胞活性，并且其活性與Beclin-1與LC3的表達呈現負相關[8]。

表2 各組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達（±s）

表2 各組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達（±s）

組別 Beclin-1 LC3第1組（n=10） 0.88±0.12 0.69±0.11第2組（n=10） 0.21±0.04* 0.31±0.08*第3組（n=10） 0.66±0.08# 0.64±0.07#第4組（n=10） 0.73±0.11# 0.69±0.12#

3 討論

阿爾茨海默病神經病理的特點之一為大腦出現顯著Aβ蛋白沉積，并且Aβ蛋白的積聚程度和阿爾茨海默病病情程度相關。當阿爾茨海默病的患者或者阿爾茨海默病的動物模型出現腦組織中Beclin蛋白中Beclin-1基因下降，Beclin-1蛋白表達出現缺失，導致自噬水平降低，自噬體減少，Aβ蛋白生成但未被降解，出現異常的沉積，最終會形成阿爾茨海默病。嗎替麥考酚酯屬于免疫抑制劑中最為典型的藥物，使用嗎替麥考酚酯能夠有效掌控阿爾茨海默病的病情發展[9]。自噬屬于存在真核細胞內細胞代謝的現象，可保持細胞內代謝環境的穩定，但自噬損傷或者自噬過度對細胞的功能產生影響。自噬具有能夠調節細胞生存、代謝、生長、死亡及神經保護性、退行性作用的重要生物學功能[9]。LC3是自噬泡內膜中的自噬調節蛋白，細胞自噬時LC3被加工并溶于細胞質，LC3-Ⅰ型與自噬泡膜的磷脂酰乙醇胺合并形成LC3-Ⅱ，發揮調節的功能，所以LC3蛋白的表達能夠直觀顯示細胞的自噬活性。

本研究運用識別實驗、水迷宮實驗檢測阿爾茨海默病大鼠學習認知能力。研究實驗中，嗎替麥考酚酯能夠緩解神經元細胞的死亡，可提高自噬的活性，能夠有效降低小膠質細胞活性，其機制與強化自噬水平及增強Beclin-1與LC3的表達有關。

綜上所述，嗎替麥考酚酯能夠有效改善阿爾茨海默病大鼠學習認知的能力，對于治療阿爾茨海默病有較好的療效。