乳腺癌分子診斷的應用進展

郟莉莉，張喆

(江蘇省腫瘤醫院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫科大學附屬腫瘤醫院 病理科，江蘇 南京 210009)

根據2020年國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC) 發布的統計數據，乳腺癌已經成為全球發病率最高的癌癥[1]，也列45歲以下女性惡性腫瘤死亡原因的第一位[2]。乳腺癌具有高度腫瘤異質性，并且發病機制尚不明確[3]。早發現、早診斷、早治療對降低乳腺癌患者的死亡率和改善預后有重要作用[4]。

分子診斷是指用分子生物學方法檢測患者體內DNA、RNA或蛋白質分子的結構、表達、表觀遺傳特異性改變的方法和過程[5]。通過分子診斷收集到的資料有助于腫瘤的診斷、分型、推測預后，并且可以結合臨床資料和病理診斷結果對患者進行個體化的精準治療。作者就乳腺癌分子診斷技術的應用進展進行綜述。

1 乳腺癌的分子診斷技術

1.1 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術

FISH技術的原理是將熒光素直接或間接標記的核酸探針與待測樣本中的核酸靶序列按堿基互補配對原則進行雜交，之后通過熒光顯微鏡直接觀察和分析細胞核內染色體上的基因狀態[6]。可以在熒光顯微鏡下對熒光標記的DNA序列進行定性、定量或相對定位分析。FISH技術是乳腺癌分子診斷中應用最廣泛的一種檢測手段。蔣依娜等[7]用FISH法檢測568例免疫組化表達為2+的HER2基因擴增不確定病例樣本的基因狀態，認為FISH法可靠性和準確性更高。陳輝等[8]用FISH法檢測HER2非典型擴增和不確定狀態的乳腺癌樣本共336例，發現非典型擴增和不確定的病例均有典型的雌激素受體陽性。雙倍體/多倍體的病例更具有侵略性。

1.2 實時熒光定量聚合酶聯反應(quantitative realtime PCR, qRT- PCR)技術

qRT- PCR是對PCR擴增中添加熒光基團并對全程進行實時監測，根據反應時間和熒光信號變化繪制成曲線并進行定量分析。陸慧琦等[9]用qRT- PCR法測定乳腺癌組織中人表皮生長因子受體2(human epithelial growth factor receptor- 2,HER2)基因表達，并用免疫組化法印證，認為用qRT- PCR法進行相關指標的檢測，可為臨床對乳腺癌患者術后選擇合理治療方案提供依據。鄧艷華等[10]應用雙標準曲線的qRT- PCR檢測HER2在乳腺癌臨床診治中的可行性，實驗用FISH法作對照，結果發現,雙標準曲線的qRT- PCR法檢測HER2基因擴增水平準確可信。

1.3 基因芯片技術

基因芯片技術是把大量已知序列探針集成在同一個基片上，通過堿基互補配對的原則，將標記的靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交，通過檢測雜交信號，對細胞或組織中的基因信息進行分析。基因芯片技術可以一次性檢測同一組織中數千個基因表達譜的差異，學者們將其應用到乳腺癌診斷和治療中，可以通過檢測對比乳腺癌組織和正常乳腺組織基因之間的表達差異，從而篩選出與乳腺癌發生發展相關的基因，用于乳腺癌的治療和預防。張莉等[11]篩選乳腺癌基因芯片中差異表達的差異非編碼RNA，并分析其在乳腺癌中的表達情況；魏選東[12]從歐洲分子生物學實驗室獲取乳腺癌基因芯片，并對芯片數據進行挖掘，篩選出決定乳腺癌預后的核心基因，并評估其對預后的預測效果。

1.4 高通量測序技術

高通量測序又稱為“新一代”測序技術(new generation sequencing technology，NGS)，可以一次同時對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序，并且可以短讀長測序[13]，其高通量很大程度上節約了檢測時間，在保證準確性的前提下也降低了成本。NGS是目前主流的腫瘤患者基因檢測手段，其為疾病的鑒別診斷、預后預測和患者的個體化、精準化治療都提供了重要的依據。孫思等[14]利用NGS分析遺傳性乳腺癌患者BRCA1/2基因遺傳突變的情況，發現有家族史乳腺癌患者BRCA1/2基因的有害變異率顯著高于正常對照組，利用NGS可以有效地進行家系遺傳分析，并可以有效篩選出乳腺癌BRCA1/2基因的突變。Roy- chowdhuri等[15]通過NGS分析454個乳腺癌樣本，其中包含46個乳腺癌常見癌基因，經檢測發現TP53基因突變率高達38.8%，表明可能存在乳腺癌治療的潛在靶點。

1.5 基于NGS的循環腫瘤DNA檢測

在目前的臨床診斷中針對乳腺癌的確診和分子分型的檢測采用的都是患者的腫瘤組織樣本。但是腫瘤組織樣本受到使用損耗局限檢測次數、再次取材的困難以及穿刺活檢樣本腫瘤異質性可能影響檢測結果的種種局限，僅使用患者既往手術切除的腫瘤樣本或者穿刺活檢組織樣本已經無法滿足不斷發展的患者術后腫瘤狀態動態監測和個體化治療的需求，液體活檢技術(liquid biopsy)對乳腺癌的診療和動態監測起到了重要作用，檢測循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)成為新興熱點[16]。

ctDNA是腫瘤細胞釋放至外周血中的單鏈或雙鏈DNA，目前對ctDNA的檢測方法是在NGS基礎上進行的，通過選定一定數量的乳腺癌相關基因，對外周血中的ctDNA進行測序。根據對基因富集策略的不同分為靶向擴增子測序(targeted amplicon sequencing，TAS)和目標序列捕獲測序(targetde capture sequencing，TCS)[17]。易宗華等[18]用NGS和TCS檢測804例轉移性乳腺癌患者ctDNA樣本中TP53基因的突變情況，發現外顯子5- 8的TP53突變是轉移性乳腺癌患者無病生存期短的獨立預后指標。

2 分子診斷技術的優缺點對比分析

FISH所用的熒光素沒有放射性，清潔安全；實驗周期短，探針穩定性好，定位準確，特異性高，得到結果用時短；其經過多次免疫化學反應，雜交信號增強，靈敏度增高；多熒光通道可檢測同一細胞核中的多種序列；既可以在玻片上顯示中期染色體數量和結構的變化，也可以在懸液中顯示期間染色體DNA結構[19]。其不足是：檢測費用較高；實驗條件要求嚴格，實驗操作人員和判讀人員都需要具備專業知識和操作資質；待測樣本在熒光顯微鏡下無法直接觀察組織結構形態，難以區分癌組織和其他組織；最終制作完成的切片熒光信號會隨時間衰減，無法長期保存[6]。

qRT- PCR的優點體現在標本來源容易，定量范圍寬，檢測結果準確度高，靈敏度高，特異性強，可重復性好，檢測方便快捷，實驗過程全封閉，自動化程度較高，并且具有高通量的優勢；其缺陷為無法檢測擴增產物的大小，實驗成本較高且受到熒光素種類和檢測光源的局限[20]。

基因芯片技術顯著優點是高通量檢測、特異性強、自動化操作和快速高效；不足為技術成本高、工序復雜、DNA芯片上原位合成探針時容易混入錯誤的片段或者雜質造成污染等。

NGS優點是通量高、耗時短、精確性高，污染可能性極低，可以用于觀察表觀遺傳過程、驗證癌癥因果關系、推測腫瘤進展和指導疾病治療；不足在于成本高、操作難，對數據分析平臺要求高，需要強大的計算機平臺支持和專門的公司進行數據和圖像處理分析、存檔分類。

ctDNA檢測的優點是創傷小、取材方便、靈敏度高，可持續監測；其缺點是ctDNA含量低、易降解，需要高濃度的ctDNA、檢測成本高。

雖然FISH檢測費用比免疫組化檢測高，但比qDNA、基因芯片、NGS、ctDNA檢測低，FISH也是目前識別HER2基因拷貝數的金標準，可以直接指導臨床靶向用藥；qPCR對拷貝數變異、突變檢測無法檢測；基因芯片技術雖然有高通量的優點，但是其探針合成易造成污染，也無法對待測基因進行精確定位；NGS雖然成本高而且對分析平臺要求很高，但是可以進行高通量多位點和未知基因突變的檢測，可以為乳腺癌的治療篩選更多靶標；ctDNA檢測可以通過外周血中的ctDNA檢測基因突變和對腫瘤發展進行持續的動態監測。

3 總結與展望

分子診斷技術目前已經普遍應用于臨床診斷和治療，同時廣大臨床醫生和科研人員也使用分子診斷技術進行科學研究，在分子診斷技術的支持下，科研人員可以對乳腺癌的基因突變、早期診斷、靶向用藥、預后判斷有更深入透徹的研究。雖然分子診斷技術在臨床上的使用已有時日，但由于平臺和技術資源的要求限制，并不是所有醫院都具備建立分子實驗室的能力。在檢測質量方面，由于各種檢測的方法有不確定性，所以目前并沒有關于檢測的統一標準，各個實驗室的質量水平也很難統一評估；另一方面分子檢測的成本高，患者往往會有經濟上的顧慮，需要臨床醫生對患者的病情作全面評估并同時考慮患者的經濟情況，針對不同需求合理選擇一種或多種分子檢測方法，相互發揮優勢、彌補不足，使患者得到更精準的治療和預后相關的動態監測。科技推動乳腺癌分子診斷技術走進了新時代，在未來除了對未知領域的探索，更需要建立業內統一認可的診斷標準，更精準地為患者提供個體化治療，讓更多的乳腺癌患者從中獲益。