數(shù)字PCR在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

鄭雯馨，滕 達(dá)

（內(nèi)蒙古中普檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

近年來(lái)，在食品領(lǐng)域，我國(guó)與世界各個(gè)國(guó)家的貿(mào)易合作不斷被深化，食品安全也開始成為市場(chǎng)監(jiān)管的關(guān)鍵[1]。根據(jù)調(diào)查，在國(guó)際食品貿(mào)易當(dāng)中，每年由于食品中摻雜動(dòng)植物源成分或者由于失信問(wèn)題而造成的損失超過(guò)400億美元。在這樣的背景下，運(yùn)用非培養(yǎng)宿主式的檢測(cè)方法是十分重要的，這種方法具有精準(zhǔn)、快速的特點(diǎn)，可以有效降低在生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售以及儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)中出現(xiàn)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可以提高對(duì)各類食品的監(jiān)管效率。數(shù)字PCR技術(shù)在這樣的背景下出現(xiàn)，且已得到了廣泛的應(yīng)用。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的概述

數(shù)字PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的方法。該技術(shù)可以被細(xì)分為微滴式和芯片式兩種類型。其中微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的特點(diǎn)是將待檢測(cè)樣本反應(yīng)液分為由若干乳液包裹的微液滴，需要對(duì)不同的微滴內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)相應(yīng)的比重來(lái)對(duì)目的序列的含量進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。而芯片式數(shù)字PCR技術(shù)則需要利用微流控技術(shù)將反應(yīng)倉(cāng)導(dǎo)入到芯片上，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。此外，還可以利用相近基因芯片法對(duì)反應(yīng)倉(cāng)中的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目的序列含量進(jìn)行計(jì)算和判斷。上述方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，樣品都會(huì)發(fā)生20 000多個(gè)PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)定量檢測(cè)的要求[2]。

數(shù)字PCR技術(shù)包括以下3個(gè)應(yīng)用步驟。①稀釋核酸模板，然后將其分配到獨(dú)立的反應(yīng)單元當(dāng)中，不同單元所對(duì)應(yīng)的DNA模板分子是不同的。②在反應(yīng)單元中開展PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并在反應(yīng)完成后統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)。③統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)陽(yáng)性結(jié)果在反應(yīng)單元中的比例，然后推算核酸序列拷貝數(shù)。

2 數(shù)字PCR在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

2.1 方便性

在過(guò)去，食品安全檢測(cè)過(guò)程需要開展大量復(fù)雜的操作，這些操作不僅需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能完成，同時(shí)也需要投入大量的人工成本和材料成本，這導(dǎo)致相關(guān)檢測(cè)部門和檢測(cè)企業(yè)的資金投入過(guò)多[3]。而在數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用后，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程操作方便，顯著降低了成本投入。這是因?yàn)閿?shù)字PCR技術(shù)可以借助自動(dòng)化設(shè)備對(duì)食品中的微生物含量和種類進(jìn)行檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)使檢測(cè)活動(dòng)具有周期性。由此可見，數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用使相關(guān)操作變得簡(jiǎn)單與方便，實(shí)現(xiàn)了由多人食品安全檢測(cè)到一人檢測(cè)的轉(zhuǎn)變，減少了人工投入。

2.2 快捷性

在食品安全檢測(cè)中，腐敗菌的檢測(cè)周期通常在2～5 d，這難以滿足實(shí)際檢測(cè)需要，在檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)之間表現(xiàn)出了時(shí)間上的落差，具有滯后性的特點(diǎn)。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果出來(lái)時(shí)，很多食品都已經(jīng)被投放到市場(chǎng)。而數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用可以有效解決這一問(wèn)題，具有快捷性的特征，能夠大幅度縮短食品中腐敗菌的檢測(cè)周期，通常在24 h內(nèi)就可以獲得檢測(cè)結(jié)果。簡(jiǎn)單的食品檢測(cè)項(xiàng)目的檢測(cè)時(shí)間可以控制在5 h左右，不會(huì)對(duì)市場(chǎng)銷售產(chǎn)生影響，提高了市場(chǎng)投放效率，能夠?yàn)槭称飞a(chǎn)企業(yè)的發(fā)展提供推動(dòng)力。

2.3 準(zhǔn)確性

與其他產(chǎn)品相似，食品在投放市場(chǎng)的過(guò)程中需要經(jīng)歷出庫(kù)、運(yùn)輸、貨架擺放等一系列過(guò)程[4]。在這個(gè)過(guò)程中，食品可能會(huì)受到微生物污染，進(jìn)而影響食用者的生命健康。而傳統(tǒng)食品安全檢測(cè)方法，難以將污染性微生物從食品中剝離，同時(shí)也難以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。數(shù)字PCR技術(shù)可以有效解決以上問(wèn)題，能夠確定食品中的微生物種類和含量，提高了檢測(cè)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

3 數(shù)字PCR在食品安全檢測(cè)中的具體應(yīng)用

3.1 在沙門氏菌檢測(cè)中的具體應(yīng)用

在食品安全檢測(cè)過(guò)程中，需要將沙門氏菌檢測(cè)作為重點(diǎn)工作。除了常規(guī)的數(shù)字PCR技術(shù)之外，套式技術(shù)和多重技術(shù)都在該領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。在檢測(cè)要求高、檢測(cè)條件復(fù)雜的場(chǎng)合，單獨(dú)使用某種技術(shù)難以達(dá)到預(yù)期的效果，因此需要合并使用多種技術(shù)來(lái)對(duì)多種病菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)[5]。尤其是在玉米、番茄等轉(zhuǎn)基因類食品的檢測(cè)中，多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)在方便快捷方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)十分明顯。數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)步驟如下。①根據(jù)沙門氏菌的基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物以及基因擴(kuò)增片段。②設(shè)置合適的反應(yīng)條件，確保在該條件下引物可與沙門氏菌產(chǎn)生反應(yīng)。③在兩條引物之間設(shè)計(jì)半套式引物，進(jìn)而準(zhǔn)確檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

3.2 在李斯特菌檢測(cè)中的具體應(yīng)用

李斯特菌廣泛存在于環(huán)境中。該種細(xì)菌將食物作為傳染源，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致命性。如果食品中李斯特菌的含量比較低，人們?cè)谑秤煤蟛⒉粫?huì)出現(xiàn)明顯的反應(yīng)，但如果含量超過(guò)一定的數(shù)量，則會(huì)表現(xiàn)出食物中毒癥狀，嚴(yán)重情況下會(huì)出現(xiàn)血液和腦組織感染。從基因?qū)W角度來(lái)講，李斯特菌中的致病因子主要是李氏溶血素O基因和內(nèi)化素基因。數(shù)字PCR技術(shù)可以將這兩種基因檢測(cè)出來(lái)，不會(huì)影響抑制酶的活性。在使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，要對(duì)擴(kuò)散的李斯特菌進(jìn)行培養(yǎng)，且要運(yùn)用化學(xué)法來(lái)對(duì)培養(yǎng)成功的物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)抽離，去除其中的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，以免影響檢測(cè)結(jié)果。此外，還要通過(guò)加熱分解的形式來(lái)提高細(xì)菌的檢出率。

3.3 在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中的具體應(yīng)用

金黃色葡萄球菌被稱為“嗜肉菌”，屬于葡萄球菌，廣泛存在于空氣、水和灰塵中。其可使奶類、肉類、蛋類、魚類及其制品出現(xiàn)質(zhì)量安全問(wèn)題。數(shù)字PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。在過(guò)去，檢測(cè)金黃色葡萄球菌時(shí)，需要先培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，而數(shù)字PCR技術(shù)可以在不培養(yǎng)的情況下直接進(jìn)行檢測(cè)，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的便捷性，同時(shí)縮短了檢測(cè)周期。但也正是如此，在檢測(cè)的時(shí)候其他病菌容易滲透和侵入。在這樣的情況下，使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要將大腸桿菌作為干擾，這樣可以避免其他病菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，同時(shí)能在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地將病原菌檢測(cè)出來(lái)。但在這個(gè)過(guò)程中要確保大腸桿菌的數(shù)量大于金黃色葡萄球菌的數(shù)量。

3.4 在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)植物類食品中的安全檢測(cè)

為了應(yīng)對(duì)市場(chǎng)需求，近年來(lái)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖呈現(xiàn)出了集約化與規(guī)模化的發(fā)展趨勢(shì)，這也對(duì)相關(guān)食品的安全檢測(cè)工作提出了更高的要求。水產(chǎn)生物的致病菌呈現(xiàn)出了由單一化到多元化和復(fù)雜化的轉(zhuǎn)變，這不僅影響到了水產(chǎn)養(yǎng)殖的效果，同時(shí)也影響到了相關(guān)食品的安全，進(jìn)而會(huì)制約行業(yè)的發(fā)展。而數(shù)字PCR技術(shù)可以利用基因序列的保守性來(lái)進(jìn)行安全檢測(cè)，建立檢定擬態(tài)弧菌的專門PCR技術(shù)，增強(qiáng)對(duì)嗜水氣單胞菌、鰻弧菌等多種病原菌檢測(cè)的精準(zhǔn)性。除了能夠?qū)λa(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)植物類食品中的病原菌含量進(jìn)行檢測(cè)之外，還可以計(jì)算出病原菌的發(fā)展周期，這不僅確保了相關(guān)食品的安全性，同時(shí)也為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的安全生產(chǎn)提供了保障。

3.5 在生鮮肉類食品中的安全檢測(cè)

在生活水平不斷提高的背景下，人們對(duì)生鮮肉類食品的需求也在增加，相關(guān)檢測(cè)單位將這類食品的安全檢測(cè)作為了重點(diǎn)。但市場(chǎng)上生鮮肉的種類比較多，品質(zhì)也表現(xiàn)出了明顯的差異，這增加了檢測(cè)的難度。數(shù)字PCR技術(shù)可以從生鮮類食品的肌肉細(xì)胞線粒體中提取出相應(yīng)的DNA，并合理選擇和設(shè)計(jì)引物，在擴(kuò)增之后得到DNA片段，然后開展檢測(cè)工作。通過(guò)這種方式，可以縮短檢測(cè)周期，部分檢測(cè)單位能夠在5 h左右得到檢測(cè)結(jié)果，大大縮短了從檢測(cè)到食品投放的時(shí)間，滿足了人們對(duì)生鮮肉在安全和新鮮方面的需求[6]。

4 數(shù)字PCR在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

4.1 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方面發(fā)揮了重要作用。目前常用的方法為dPCR定性分析法和qPCR定量分析法。其中qPCR定量分析法在應(yīng)用的過(guò)程中容易受到轉(zhuǎn)基因核酸含量與基質(zhì)的影響，而dPCR定性分析法所受的影響比較小，因此應(yīng)用范圍更廣，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的靈敏性和較高的拷貝數(shù)分辨精度。

4.2 動(dòng)物源成分摻雜

在肉制品生產(chǎn)過(guò)程中，部分非法分子會(huì)在其中摻雜一些未注明的肉類成分。其中常見的是在高價(jià)格的肉制品當(dāng)中摻雜低廉的肉制品，這損害了消費(fèi)者的利益，同時(shí)也在食品安全方面增加了隱患。而通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)，可以對(duì)肉制品當(dāng)中的動(dòng)物源成分進(jìn)行精準(zhǔn)、定量測(cè)量，同時(shí)還可以對(duì)摻雜的成分進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。①利用數(shù)字PCR技術(shù)可以測(cè)定動(dòng)物源成分的準(zhǔn)確拷貝數(shù)，經(jīng)過(guò)計(jì)算之后得到拷貝數(shù)與樣本質(zhì)量的比例數(shù)，然后將其與標(biāo)準(zhǔn)比例數(shù)進(jìn)行對(duì)比，以此來(lái)判斷產(chǎn)品中目標(biāo)動(dòng)物源成分的摻雜情況。②通過(guò)直接拷貝數(shù)的比例可以對(duì)摻雜情況進(jìn)行判別。這需要工作人員從不同類型動(dòng)物組織或者含有動(dòng)物源的食物當(dāng)中提取核酸，然后對(duì)各種類目標(biāo)基因的拷貝數(shù)比值進(jìn)行測(cè)量，明確基因拷貝數(shù)和質(zhì)量之間的關(guān)系，然后基于該比例關(guān)系換算出不同種類物質(zhì)的添加量，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物源成分的定量檢測(cè)。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，近年來(lái)，多樣化轉(zhuǎn)基因生物的出現(xiàn)使食品安全檢測(cè)的復(fù)雜性增強(qiáng)，同時(shí)也使檢測(cè)難度進(jìn)一步提升。微生物種類多樣、構(gòu)型復(fù)雜以及感染宿主范圍廣泛，這也增加了食品安全檢測(cè)的難度。數(shù)字PCR技術(shù)具有方便性、快捷性和準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，在沙門氏菌檢測(cè)、李斯特菌檢測(cè)以及金黃色葡萄球菌檢測(cè)等方面都表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)植物類食品和生鮮肉類食品的安全提供了保障。