魚(yú)類生殖干細(xì)胞體外誘導(dǎo)精子發(fā)生研究取得進(jìn)展

近日，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院李名友和桂朗團(tuán)隊(duì)開(kāi)創(chuàng)性地應(yīng)用魚(yú)類生殖干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，首次建立了馬口魚(yú)的精原干細(xì)胞系和長(zhǎng)江刀鱭的性腺體細(xì)胞系，通過(guò)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后成功產(chǎn)生精子，突破了目前世界范圍內(nèi)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類生殖干細(xì)胞無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)的問(wèn)題，為魚(yú)類瀕危物種保護(hù)、重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類種質(zhì)創(chuàng)制、生殖干細(xì)胞基因編輯等提供了一條新途徑。

精原干細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂產(chǎn)生精子，將遺傳信息傳遞給下一代，從而能保證物種的延續(xù)。大量的研究表明，體外重塑精子發(fā)生微環(huán)境可誘導(dǎo)精原干細(xì)胞系分化產(chǎn)生精子。在魚(yú)類研究中，體外獲得精原干細(xì)胞系并能夠進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)是關(guān)鍵性的技術(shù)難題。全球的研究機(jī)構(gòu)都在探索可以獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)的精原干細(xì)胞系，但通常只能獲得最長(zhǎng)1個(gè)月的魚(yú)類精原干細(xì)胞系。

在本研究中，馬口魚(yú)精原干細(xì)胞系經(jīng)過(guò)2年多的培養(yǎng)，仍具有二倍體核型，生長(zhǎng)穩(wěn)定，具有典型的精原干細(xì)胞基因表達(dá)模式。在體外培養(yǎng)條件下，馬口魚(yú)精原干細(xì)胞系可以誘導(dǎo)分化為精子和其他不同類型的體細(xì)胞。在體外培養(yǎng)條件下，馬口魚(yú)精原干細(xì)胞系在懸浮培養(yǎng)中形成擬胚體。用視黃酸連續(xù)處理1周后，分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞等多種體細(xì)胞，這表明馬口魚(yú)精原干細(xì)胞系在體外具有多能性。為了模擬體外減數(shù)分裂過(guò)程，團(tuán)隊(duì)將馬口魚(yú)精原干細(xì)胞系與馬口魚(yú)精巢細(xì)胞共培養(yǎng)。分別收集精巢細(xì)胞和表達(dá)紅色熒光(RFP)的馬口魚(yú)精原干細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行染色體檢查，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以進(jìn)入并完成減數(shù)分裂以產(chǎn)生單倍體產(chǎn)物。在共培養(yǎng)的第14天，觀察到表達(dá)RFP的精子細(xì)胞，表明馬口魚(yú)精原干細(xì)胞逐漸誘導(dǎo)為未成熟精子細(xì)胞。共培養(yǎng)16 d后，觀察到表達(dá)RFP的馬口魚(yú)精原干細(xì)胞分化為更成熟的精子，尾部有輕微擺動(dòng)行為。本研究驗(yàn)證了在合適的誘導(dǎo)條件下，馬口魚(yú)精原干細(xì)胞可以誘導(dǎo)產(chǎn)生精子細(xì)胞。

研究表明，馬口魚(yú)精原干細(xì)胞在體內(nèi)也具有多能性，將表達(dá)RFP的馬口魚(yú)精原干細(xì)胞移植到斑馬魚(yú)胚胎中發(fā)現(xiàn)，供體與斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育形成了嵌合體并表現(xiàn)出正常的增殖和分化能力，能發(fā)育成來(lái)源于3個(gè)不同胚層的細(xì)胞。

與此同時(shí)，研究表明，體細(xì)胞在精子發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色，可通過(guò)運(yùn)用體細(xì)胞與精原干細(xì)胞共培養(yǎng)條件模擬體內(nèi)微環(huán)境，誘導(dǎo)精原干細(xì)胞體外分化，經(jīng)歷減數(shù)分裂產(chǎn)生精子細(xì)胞。在長(zhǎng)江刀鱭體細(xì)胞系的研究中，將刀鱭性腺體細(xì)胞與表達(dá)RFP的青鳉精原干細(xì)胞系共同培養(yǎng)2 d后，可以觀察到緊密排列的多細(xì)胞集落，具有明顯的胚狀體邊界。青鳉精原干細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化，觀察到圓形精子細(xì)胞轉(zhuǎn)化為伸長(zhǎng)的精子細(xì)胞，并帶有新形成的鞭毛。因此，刀鱭性腺體細(xì)胞具有誘導(dǎo)青鳉精原干細(xì)胞分化為精子的能力。

此次研究突破了養(yǎng)殖魚(yú)類精原干細(xì)胞無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)的問(wèn)題，通過(guò)體內(nèi)外的多角度誘導(dǎo)和移植研究，使精原干細(xì)胞在體外形成了精子。這為對(duì)精原干細(xì)胞的進(jìn)一步研究和認(rèn)識(shí)提供了基礎(chǔ)，也為保護(hù)魚(yú)類瀕危物種、優(yōu)化具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值魚(yú)類育種的方式提供了新的思路。今后，李名友、桂朗團(tuán)隊(duì)還將結(jié)合干細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)技術(shù)、基因編輯技術(shù)和細(xì)胞移植技術(shù)等多種研究手段，建立繁殖困難、繁殖周期長(zhǎng)、珍稀或?yàn)l危魚(yú)類生殖干細(xì)胞體系，開(kāi)展生殖干細(xì)胞基因編輯介導(dǎo)的養(yǎng)殖魚(yú)類優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)制新技術(shù)。

此次兩項(xiàng)研究成果以“Generation of a normal long-term-cultured Chinese hook snout carp spermatogonial stem cell line capable of sperm production in vitro”和“Establishment of aCoilianasusgonadal somatic cell line capable of sperm induction in vitro”為題發(fā)表于Biology上。