離體胎盤灌注模型應用的研究進展

唐代鈺 董曉靜

胎盤是連接母胎的重要部分，有屏障作用、物質交換、分泌激素、免疫調控等功能。各種妊娠期母兒疾病均與胎盤功能密切相關。涉及到胎盤的許多研究因倫理問題無法直接在人體開展，動物實驗的結果雖有一定參考意義，但又難以全面外推至人體。離體胎盤灌注模型的提出解決了這一難題。

離體胎盤灌注模型最早是由Panigel等[1]提出的，通過灌流管連接供應同一胎盤小葉的臍靜脈與臍動脈建立胎兒側循環，灌流管插入螺旋動脈殘端建立母體側循環，主要用于藥物經胎盤轉運的相關研究。后經過Schneider等[2]和Miller等[3]的改進，逐漸形成了如下成熟的離體胎盤灌注模型。

收集胎盤并進行灌洗后，在保留完整胎盤的基礎上，確定供應同一胎盤小葉的臍靜脈與臍動脈，結扎其分支，穿刺置管建立該小葉的胎兒循環，當臍動脈端灌入量與臍靜脈端流出量相等時說明該胎盤小葉無滲漏，去除多余的胎盤組織，在該胎盤母體側絨毛間隙內插入兩灌流管2～3 mm建立母體循環。離體胎盤灌注模型建立后，母體側灌注液用95%的O2和5%的CO2混合氣體進行氧合，胎兒側則用95%的N2和5%的CO2混合氣體充氣，以模擬母體血與胎兒臍動脈血的體內狀態[4]。實驗過程中可通過測量胎兒循環側pH、溫度、壓力、耗氧量、胎兒凈氧轉移、乳酸產量等指標來衡量離體組織活性，但胎兒側灌注液體積損失測量則被認為是最佳的評價指標，考慮液體殘留及水分蒸發，通常胎兒側灌注液損失量不超過2～4 mL/min提示該循環建立成功。安替比林是一種親水性的小分子化合物，通過被動擴散進入胎盤，因此常被作為胎盤轉運研究的陽性參照物，在母體側以100%的濃度加入安替比林，灌注2.5 h后安替比林的F/M值>0.75才能說明模型建立成功[4]。經不斷改進后的離體胎盤灌注模型，被應用于藥物與疾病的各方面研究。

一、藥物經胎盤轉運

有研究發現，約23%～85%的妊娠婦女在妊娠期間需要進行藥物治療[5]，但胎盤屏障作用有限，部分對胚胎有毒性作用的藥物進入母體循環后可能通過胎盤進入胎兒循環，從而影響胎兒的生長發育，甚至產生致畸或致死作用。因此，評估胎兒的藥物暴露水平成為衡量妊娠期用藥安全的重要指標。離體胎盤灌注模型保留了完整的胎盤結構，是評估藥物經胎盤轉運的最經典的方法。

藥物胎盤轉運機制包括被動擴散、主動運輸、易化擴散、過濾和胞飲作用。其中被動擴散是胎盤轉運的重要機制，受物質分子量大小、離子化程度、脂溶性高低等因素影響。通過在開放或封閉離體胎盤灌注系統中進行藥物經胎盤轉運實驗發現，部分藥物以被動擴散形式通過胎盤屏障進入母胎循環，例如抗病毒藥物替諾福韋[6]、阿昔洛韋[7]，內分泌用藥溴隱亭[8]等。這些被動擴散物質游離與結合狀態的平衡很大程度上影響其經胎盤的運輸，故而母體側血清白蛋白與胎兒側血清白蛋白濃度是該類物質經胎盤轉運的重要限制因素。例如溴隱亭與母體側蛋白結合率高，其分子量較大，研究顯示只有微量溴隱亭通過胎盤轉運，其胎兒轉移率約6%[8]。而Lee等[9]的研究則表明，降糖藥物二甲雙胍的胎盤轉運是由OCT3(organic cation transporter)介導的。Kurosawa等[10]和Freriksen等[11]通過采集不同藥物經胎盤轉運的數據結合藥代動力學模型分析以及hutson等[12]進行的一項meta分析(n=26)均表明，離體胎盤灌注模型進行藥物實驗所得數據與臨床觀察臍血中相關藥物數據高度一致，這表明離體胎盤灌注模型是研究藥物經胎盤轉運的理想模型。

既往研究證實，萬古霉素[13]、羅格列酮[14]、人胰島素[15]、溴隱亭[8]等藥物極少甚至不透過胎盤，在孕期使用有較高的安全性；而縮宮素即使在低于生理濃度的條件下，仍可以由母體側轉運至胎兒側[16]，故在臨床上使用縮宮素進行催產時，應以與生理分娩進展速率相適應的最低劑量給藥；西地那非是一種通過增強一氧化氮(NO)途徑介導血管舒張的藥物，動物實驗證明其可通過改善子宮胎盤血供從而改善子癇前期母胎結局[17]，但在一項大型臨床實驗研究中發現，西地那非的應用可能導致一些新生兒疾病甚至新生兒死亡[18]，后利用體外胎盤灌注證實，西地那非可通過健康婦女胎盤，且在子癇前期婦女胎盤中，越早孕周西地那非透過胎盤的劑量越大[14]。這些結果對于指導西地那非的臨床用藥有很大參考價值。

二、毒物經胎盤轉運

甲醛是常見的家居污染物，動物實驗證實暴露于甲醛的小鼠均出現了生殖系統損害以及胎兒畸形[19]和胎盤損傷[20]，人離體胎盤灌注模型實驗證實，甲醛從母體側經胎盤迅速轉移至胎兒側，通過與蛋白質、核酸、氨基酸等多種生物分子代謝并發生反應，引起DNA-蛋白質交聯，從而在胎盤和胎兒組織中積累，造成胎盤滋養細胞層出現氧化應激樣反應，導致胎盤功能障礙[21]。對羥基苯甲酸酯是一類廣泛用于日常用品的防腐劑，存在潛在的內分泌干擾作用，孕期苯甲酸酯的暴露可能導致胎兒體重過度增長[22]，而體外胎盤實驗則證實，不同種類苯甲酸酯以及不同濃度苯甲酸酯經胎盤轉運時無明顯運輸動力學差異[23]，但其對胎兒的影響仍需進一步實驗研究。草甘膦是眾多除草劑的有效成分，既往也被認為是除草劑毒性的主要成分，但在離體胎盤模型實驗中發現，以草甘膦為基礎的復方農藥比單獨的草甘膦對胎盤循環和其完整性有更嚴重的損害，這些復方農藥的配方里含有聚氧乙醇胺、多環芳烴或重金屬等，這可能是其對胎盤毒性高于單獨草甘膦的原因，這也解釋了暴露于不含草甘膦的殺蟲劑或其他環境污染物的孕婦亦出現不良妊娠結局的原因[24]。因此，僅以草甘膦作為除草劑毒性所在的說法有待商榷。大量研究表明，空氣污染與不良妊娠結局之間存在一定關聯，但對于污染顆粒毒性背后機制以及是否能穿過胎盤進入胎兒循環仍未可知。Bongaerts等[25]利用離體胎盤灌注模型進行柴油尾氣顆粒(diesel exhaust particles,DEPs)的轉運和積累研究發現，經過6 h灌注后，DEPs的胎母比值接近于零，在胎兒側灌注液中沒有檢測到明顯DEPs顆粒，但在胎盤組織，尤其是合胞滋養層中，檢測到大量DEPs顆粒蓄積，并在胎兒側上皮細胞中檢測到少量DEPs顆粒，表明其毒性作用主要是對胎盤功能影響，但該實驗在胎兒側上皮細胞檢測到少量的DEPs，故亦不排除其直接的胎兒毒性作用。氯氰菊酯、唑丙環唑、比特醇等農藥中含有的化學物品[26]、納米級粒子[27]等均可通過胎盤屏障進入胎兒循環。人離體胎盤灌注模型是一個有價值的研究環境污染物對母胎影響的系統，值得在環境化學物質研究中得到越來越多關注。

三、建立疾病胎盤模型及研究相關疾病發生發展機制

妊娠合并癥與并發癥多通過影響胎盤功能從而影響胎兒的生長發育，建立體外的胎盤疾病模型有助于進一步研究的開展。子癇前期(preeclampsia,PE)是一種嚴重影響母胎安全的妊娠期高血壓疾病，目前其發病機制被認為與孕早期胎盤淺著床以及孕中晚期胎盤氧化應激反應高度相關，建立PE的體外胎盤模型有助于更加透徹的研究其發病機制。對健康離體胎盤組織進行缺氧灌注后發現，母體側及胎兒側不同炎癥因子、氧化應激標志物，例如內皮素-1(ET-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)均有不同水平的升高，很好的模擬了PE的胎盤炎癥反應[28]；通過對比PE產婦及正常產婦離體胎盤的三維血管模型發現，PE產婦胎盤血管床體積較正常產婦減少，1～3級靜脈和2～3級動脈管徑變小，外周動靜脈比增高，這可能是導致PE胎盤灌注不足的原因之一[29]。PE離體胎盤微囊泡結合的一氧化氮合酶(STBEV-eNOS)水平較低導致NO減少[30]，大電導鈣激活鉀通道(BKCA通道)的表達下調[17]都可能是導致胎盤血管收縮的原因。從PE離體胎盤分離的微囊泡(STBEV)能導致血小板的活化[31]，這可能是PE患者血液高凝的原因。妊娠期糖尿病可能導致早期流產、早產、胎兒生長受限、胎兒畸形、巨大兒等不良妊娠結局，在高糖灌注液模擬的妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)胎盤模型中，發現胎兒血管阻力顯著增加，同時檢測到內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和蛋白激酶(Akt)磷酸化水平降低，這一結果提示高糖通過降低NO的生成，導致血管阻力升高[32]。被瘧原蟲感染的紅細胞表面表達惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1(PfEMP1)，介導細胞與內皮細胞、血小板、紅細胞和合胞滋養細胞的粘附，從而逃避循環和免疫，VAR2CSA作為PfEMP1家族的一員，與硫酸軟骨素A(chondroitin sulfuric A,CSA)結合，從而在體外胎盤灌注模型中積累，其分布與自然感染相似，而可溶性CSA和抗VAR2CSA抗體抑制了感染紅細胞的結合[33]，這一發現為胎盤瘧疾疫苗的開發提供了新的研究方案。基于此，Pehrson等[34]在隨后的研究中發現，一種脂質體制劑中的ID1-ID2a蛋白(目前處于I期試驗)有效地誘導了抑制胎盤組織中感染紅細胞粘附的抗體。在對胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)胎盤的研究中發現，吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)的缺乏會導致色氨酸降解減少，其產生的免疫抑制及胎盤血管舒張作用減弱[35]，與FGR的發生密切相關[36]。FGR也可能與胎兒-胎盤血管反應性改變有關[37]，在對比正常胎盤與FGR胎盤離體條件下對前列腺素E2(PGE2)的反應性的實驗中發現，FGR胎盤對PGE2反應性較正常組降低[38]，證實了上述可能。灌注液中加入牛磺膽酸則可建立妊娠期肝內膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)模型[39]。利用離體胎盤灌注模型還可建立更多疾病胎盤模型，以助于更好的進行相關疾病發生發展機制的研究。

四、研究相關治療方案

針對妊娠期疾病的部分治療措施在動物實驗中有較好效果，但難以在人體直接開展實驗進行驗證，且相關治療的機制亦有待明確。例如在PE和正常的離體胎盤灌注模型的母體灌流液中加入硫酸鎂，PE組可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1(sflt-1)濃度較正常對照組并未增加[40]，提示硫酸鎂對子癇前期的治療作用僅在于預防子癇，而與PE相關的抗血管生成狀態無關。使用編碼VEGF異構體的腺病毒(Ad)在動物模型中轉導子宮動脈可以增加子宮-胎盤血液灌注量(utero-placental blood perfusion,UBF)并改善胎兒在子宮內的生長[41]，但應用于人體需驗證其安全性，在離體胎盤的實驗中發現，胎兒側靜脈灌流液中很少檢測到病毒載體，檢測到病毒載體時滴度也非常低[42]，這一結果為該治療方法應用于人體提供了一定的依據。雙胎輸血綜合征(twin to twin transfusion syndrome,TTTS)的治療十分有限，激光治療是目前較好的辦法，利用離體胎盤灌注模型研究TTTS激光治療時相關因素的影響可為治療細節提供更多的指導[43]。干細胞的移植是治療妊娠期相關疾病的研究熱點，體外胎盤灌注模型是研究間充質干細胞的胎盤遷移和定植的良好工具，將熒光標記的間充質干細胞注入離體胎盤灌注模型的血管，從胎盤中將注射后的血管分離、培養、制作切片，可見間充質干細胞穿過血管內皮屏障，實驗中同樣發現，穿過血管壁遷移的間充質干細胞仍在血管生態位內，并不遷移至周圍組織中，相關機制有待進一步研究明確[44]。

五、離體胎盤灌注的代謝

進入胎盤的物質并非均以原型進入胎兒循環，胎盤的代謝功能對于物質經胎盤轉運有一定影響。例如雌激素玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)進入胎盤后，經代謝形成活性較高的雌激素及活性較低的ZEN-14-硫酸鹽結合物釋放入母體和胎兒循環[45]。皮質醇在胎盤中被11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11β-HSD2)快速代謝為可的松，而皮質醇亦會影響色氨酸在胎盤中的代謝[46]。吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)是色氨酸(TRP)分解過程中的一種酶，絨毛膜的血管內皮細胞和蛻膜螺旋動脈的內皮細胞有其定值。IDO1介導的TRP在內皮細胞分解代謝可能產生抗菌活性和免疫抑制，以及胎盤血管緊張的松弛，從而促進胎盤灌注和胎盤及胎兒的生長。但胎盤中的TRP降解酶也會導致色氨酸的缺乏，這兩個過程的結合對建立和維持胎兒-母體免疫耐受具有重要意義[36]。胎盤對于不同物質的代謝與其含有的特殊的酶及相關蛋白有關，離體胎盤灌注模型可讓研究者更徹底地研究胎盤的代謝功能。

綜上所述，離體胎盤灌注模型在研究疾病、藥物、環境等對母胎的影響上有很高應用價值。其作為最接近生理條件的模型，是用于研究胎盤功能最經典的方法，但也存在一定的局限。例如實驗中多采用的是妊娠晚期剖宮產或順產的胎盤，妊娠晚期隨著妊娠進展，胎盤功能逐漸減退，實驗所得出相關結果難以完全代表妊娠早期的胎盤狀況；離體后的胎盤雖在接近于生理的條件下進行試驗，但在例如酶活性、轉運體數量、胎盤組織在制備過程中缺血缺氧所致本身損傷等方面與體內均有一定差異。基于此，近來有學者將離體胎盤灌注與數學建模相結合[47]，進一步明確胎盤灌注系統的各種實驗條件控制及相關影響因素，這使得研究者可更加便利地模擬各種條件下胎盤功能的研究。盡管離體胎盤灌注存在一定不足，但作為目前研究胎盤功能最經典的方法，仍然是眾多研究者的選擇，在今后的研究中，可對影響離體胎盤灌注的各項因素進行更深入的了解，以提供更加接近體內環境的離體胎盤灌注模型。