凝血因子Ⅴ與出血和血栓的相關性研究進展

李可可，肖 揚

（1.東莞東華醫院，廣東 東莞 523129；2.深圳市前海蛇口自貿區醫院，深圳 518067）

凝血因子（coagulation factor，F）Ⅴ也被稱為促凝血球蛋白原或易變因子。FⅤ作為凝血酶原復合物中活化的FⅩ（activated coagulation factor Ⅹ，FⅩa）的輔因子，對促進“凝血級聯”反應的凝塊形成極為重要。除了促凝活性外，FⅤ還可作為活化蛋白C（activated protein C，APC）的輔因子參與FVⅢa滅活，發揮其抗凝作用，并作為組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的輔因子，和TFPI/S蛋白（protein S，PS）形成三聯復合物（TFPI/PS/FⅤ），通過抑制FⅩa活性發揮其抗凝作用[1]。遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥（hereditary coagulation factor Ⅴ deficiency，FⅤD）是一種罕見的出血性疾病，但患者出血嚴重程度不等，很少出現危及生命的大出血[2]。F5基因功能缺陷型突變會導致FⅤD，重型FⅤD患者出血嚴重程度存在差異，有可能和基因突變類型有關[3-4]。F5功能獲得型突變則與血栓發生有關。本文對FⅤ的生物學特性進行概述，并介紹F5功能缺陷型突變與出血和F5功能獲得型突變與血栓的關系。

1 FⅤ的生物學特性

正常人體中，約80%的FⅤ存在于血漿中，20%存在于血小板α顆粒中。血漿FⅤ主要由肝臟合成，雖然巨核細胞也能夠合成FⅤ，但血小板FⅤ主要來源于血漿池。骨髓巨核細胞通過類似胞吞的機制將血漿FⅤ轉化為血小板FⅤ，并將其儲存在α顆粒中[5]。

血漿FⅤ是一種相對分子質量約為330 000的多結構域的單鏈糖蛋白（A1-A2-B-A3-C1-C2），以酶原形式在血漿中循環。B結構域中含有高度保守的堿性區域（aa963-aa1008）和酸性區域（aa1493-aa1537），二者的高親和力結合使FⅤ形成一個球狀結構，該結構可保護FⅤ的裂解位點不暴露，從而使FⅤ維持其酶原形式[6]。在FⅩa或凝血酶的作用下，血漿FⅤ于Arg709、Arg1018和Arg1545位點水解，釋放B結構域，轉化為有活性的FⅤ（FⅤa），其中Arg1545是關鍵切點[7]。血漿FⅤa由1條重鏈（A1-A2）和1條輕鏈（A3-C1-C2）組成，由Ca2+連接在一起。在凝血級聯反應中，在存在Ca2+的條件下，FⅤa作為FⅩa的輔因子，通過與FⅩa高親和力結合，于活化血小板的磷脂膜上形成凝血酶原復合物（FⅤa/FⅩa/PL），高效加速凝血酶原的激活，發揮促凝作用[8]。FⅤa在APC/PS復合體的作用下，于Arg306、Arg506和Arg679位點裂解滅活[9]。

最新研究發現，與血漿FⅤ相比，血小板FⅤ具有更強的促凝活性[10]。可能的原因為：（1）血小板FⅤ在被FⅩa或凝血酶激活為FⅤa之前，就已經以部分活化的形式存在；（2）相比于血漿FⅤ，血小板FⅤ可更快地被FⅩa激活[11]；（3）血小板聚集于血管受損處，活化的血小板從α顆粒中釋放FⅤ，導致血小板膜表面局部FⅤ濃度偏高[12-13]；（4）血小板FⅤa和血漿FⅤa被APC在相同的識別位點裂解，但血小板FⅤa的蛋白水解速度較慢，不能被APC完全滅活[14]。

FⅤ除了以FⅤa形式作為FⅩa的輔因子發揮促凝作用外，也具有抗凝作用[15]。其抗凝作用主要包括以下2個方面：（1）FⅤ可作為APC/PS復合物的輔因子，參與FⅧa的滅活[16]；但FⅤ只有在Arg506位點被APC剪切后，將FⅤ轉化為幾乎沒有任何促凝特性的抗凝蛋白，才發揮其輔因子的抗凝特性；FⅤ在Arg1545位點被凝血酶剪切后，失去了其作為APC/PS復合物的輔因子抗凝功能，但在Arg709和Arg1018位點上的剪切則不會影響其抗凝功能[17]；（2）作為TFPI的輔因子，FⅤ可與TFPI/PS形成三聯復合物——TFPI/PS/FⅤ，發揮抑制FXa的作用[18]。

2 F5功能缺陷型突變與出血

FⅤD是一種罕見的常染色體隱性遺傳性出血性疾病，是由F5功能缺陷導致的[19]；在人群中的發病率約為百萬分之一[20]。迄今為止，有180多種與FⅤD相關的突變（人類基因組突變數據庫www.hgmd.cf.ac.uk）被報道，類型有同義突變、錯義突變、無義突變、剪接位點突變、缺失和插入等[21]。FⅤD患者的臨床出血表現不一，從無癥狀到危及生命的出血都有發生[22]。輕度（FⅤ：C≥10%）和中度（FⅤ：C＜10%）FⅤD通常無臨床癥狀，重度（FⅤ：C＜1%）FⅤD患者的臨床表型具有一定的異質性，部分重度FⅤD患者一般只表現為皮膚瘀斑、鼻衄、月經過多和術后出血增多等輕、中度出血，但也有重度FⅤD患者表現為顱內出血、消化道出血、臍帶出血等危及生命的出血。推測這種異質性或與FⅤD患者的F5突變類型有關[10，22]。輕、中度出血多見于F5突變類型為錯義突變、無義突變、小的缺失和插入的重型FⅤD患者[21，23-24]；而危及生命的出血則常見于F5突變類型為剪切位點突變、大段缺失以及深部內含子變異的重型FⅤD患者[25-27]。這可能是因為無義突變、錯義突變、小的缺失和插入等突變類型只影響FⅤ蛋白的局部功能，對其促凝結構域的影響不大，但大段缺失、剪切位點突變以及深部內含子變異這些突變類型會導致FⅤ蛋白缺失。

可能是因為微量的FⅤ即可產生足量凝血酶，部分重度FⅤD患者的出血并沒有想象中的那么嚴重[28]。DUCKERS等[29]通過凝血酶生成試驗（thrombin generation assay，TGA）發現，在乏血小板血漿中，10%的FⅤ即可產生正常量的凝血酶。TGA是一個可系統監測待測標本中凝血酶生成總潛力的試驗，采用TGA實時監測凝血酶的含量可以有效地評價出血或血栓形成的風險[30]，尤其是對于輕、中度出血的重型FⅤD患者[31]而言，TGA有助于預測其出血風險。DUCKERS等[32]對重型FⅤD患者的富血小板血漿進行TGA，發現即使使用高濃度的組織因子觸發凝血酶生成，在重度FⅤD患者的乏血小板血漿中也未觀察到凝血酶產生，但在相應的富血小板血漿中則觀察到在低濃度組織因子中已產生可觀的凝血酶。這一現象可能是因為重度FⅤD患者雖然血漿FⅤ含量極低，但其血小板中仍含有一定量的FⅤ，可以代償血漿中減少的FⅤ，發揮促凝功能。雖然FⅤD患者血漿FⅤ水平和血小板FⅤ水平同步降低，但因為血小板FⅤ比血漿FⅤ具有更強的促凝活性，而且血小板在受損部位可以快速釋放FⅤ，形成局部高濃度，所以血小板FⅤ比血漿FⅤ促凝活性更高，極大地降低了FⅤD患者的出血風險。此外，FⅤ和生理抗凝物質TFPI可在血漿中形成復合物[33]，二者水平高度相關，從正常人群到部分（雜合子）再到嚴重（純合子）的FⅤD患者，TFPI水平逐漸降低。TFPI的減少，也間接促進了凝血酶的產生[32，34]。

目前，治療FⅤD的方法主要是輸注新鮮冰凍血漿（fresh frozen plasma，FFP）和血小板[35-36]，使FⅤ水平維持在＞20%[37]。近年來，也有新興技術被逐漸應用于FⅤD的治療，如一種新型血漿衍生FⅤ濃縮物可在體外有效糾正FⅤ缺陷血漿的活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間，或可成為FⅤD治療的有效藥物[38-39]。令人驚喜的是，目前已經有新技術通過F5修復來治療FⅤD患者，有學者通過對FⅤD患者生成誘導多能干細胞iPSCs，并應用CRISPR相關技術修復了F5的突變，恢復了FⅤD患者的FⅤ活性水平[40]。

3 F5功能獲得型突變與血栓

F5還有一些突變是功能獲得型突變，這些突變常與血栓相關。FⅤLeiden是最常見的F5功能獲得型突變，其是高加索人群靜脈血栓形成最常見的遺傳危險因素；在雜合狀態下，靜脈血栓栓塞的風險可增加5～7倍，純合子的風險甚至更高[41]。FⅤLeiden使FⅤ蛋白第506位精氨酸被谷氨酸取代，FⅤa失去1個關鍵的APC剪切位點Arg506，導致APC抵抗，即APC無法有效滅活FⅤa和FⅧa，導致體內抗凝不足[42]。另1個APC的剪切位點突變也與血栓發生有一定關聯，即FⅤ Arg306Thr（FⅤ Cambridge）[43]。臨近Arg506剪切位點的突變亦可產生APC抵抗，如FⅤBonn（Ala512Val）[44]。除此之外，氨基酸序列上遠離APC經典剪切位點的功能獲得型突變也可導致APC抵抗，如日本學者發現的純合突變FⅤNara（Trp1920Arg/W1920R）[45]與嚴重的深靜脈血栓有關，該突變在一級結構氨基酸序列上與APC的剪切位點相距較遠，但其可能通過影響FⅤ與APC的結合或FⅤ與磷脂的結合，進而影響APC的剪切效率。TGA同樣可以應用于預測F5功能獲得型突變血栓的形成。

目前，雖尚未見此類病例報道，但有理由推測F5功能獲得型突變或可通過影響其TFPI的輔因子活性來減弱TFPI抗凝功能，進而導致血栓。有關F5突變與血栓之間的關聯有待進一步研究加以證實。

4 總結

FⅤ具有促凝和抗凝雙重作用，在止血和血栓的形成中均發揮重要作用。本文著重介紹了F5突變與出血和血栓之間的關聯，該領域主要研究方向是通過研究F5的不同突變，以及對突變基因進行體外表達并對其進行TGA檢測，從而更好地預測攜帶F5突變患者的出血風險或血栓形成的風險。尤其是FⅤD患者，由于FⅤ的活性水平與疾病的嚴重程度無明顯關系，且其臨床出血表現呈現一定的異質性，故對FⅤD患者進行F5突變檢測和TGA檢測，盡早預測出血風險尤為重要，特別是對于有手術需要的FⅤD患者，可以在很大程度上規避風險。此外，對于輕、中度FⅤD患者，雖然無明顯出血傾向，但一旦患者合并病毒感染等其他突發事件，依然會增加出血風險，故需對此類情況予以足夠的重視[46]。

對于一些有血栓形成風險的F5突變或不明類型的突變，采用TGA檢測進行血栓或出血風險預測非常有必要。但目前基因檢測成本較高，普及有一定的困難，而且FⅤ蛋白的體外表達較為困難，無法更好地研究某些突變所造成的影響，而且凝血酶生成儀器我國目前也僅有幾臺，對于采用TGA預測出血或血栓形成風險有很大的不便。FⅤ作為具有促凝和抗凝雙重作用的凝血因子，對于闡明機體促凝與抗凝相互作機制有重要意義。隨著科技的發展，基因檢測技術和TGA檢測將廣泛應用于臨床，為FⅤD患者或F5功能獲得型突變患者帶來福音。