RNA結(jié)合基序蛋白家族介導的可變剪接在心肌疾病中的研究進展

劉 述，丁 虹，趙可心，白 鋒，張小衛(wèi)*

(1.蘭州大學第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科； 2.蘭州大學 第二臨床醫(yī)學院； 甘肅 蘭州 730030)

RNA剪接是從前體RNA分子中去除內(nèi)含子并將外顯子連接在一起形成成熟RNA分子的過程。這一過程主要發(fā)生在細胞核內(nèi)，大致可分為組成性剪接和可變剪接。組成型剪接被認為是默認的途徑，所有內(nèi)含子從前體mRNA中移除，外顯子以與基因組轉(zhuǎn)錄相同的順序連接在一起。而可變剪接產(chǎn)生的外顯子可以在不同的組合中插入或排除，從而從單個基因中產(chǎn)生不同功能的RNA，高達95%的人類基因具有多外顯子可變剪接形式，這表明可變剪接是人類基因組功能復雜性中最重要的組成部分之一。

1 RNA結(jié)合基序蛋白介導的可變剪接概述

剪接是由剪接體進行的，剪接體是一種大的核糖核蛋白(RNP)復合體，主要存在于細胞核的剪接斑點中。可變剪接調(diào)控是由外顯子和相鄰內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的順式調(diào)控元件介導的。順式調(diào)控元件可以通過招募與RNA分子結(jié)合并充當反式作用因子的RNA結(jié)合蛋白來促進外顯子的保留或剪切。

對可變剪接的適當調(diào)控對細胞生理學很重要，與主要反映轉(zhuǎn)錄本豐富度的啟動子活性不同，可變剪接影響mRNAs及其潛在編碼蛋白的結(jié)構(gòu)。因此，它會影響許多基因產(chǎn)物的結(jié)合特性、細胞內(nèi)定位、酶活性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和翻譯后修飾[1]。所以異常剪接可能導致細胞功能障礙和臨床表現(xiàn)。越來越多的疾病，如癌、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等都與可變剪接有關。然而，可變剪接的調(diào)控在心臟病研究中受到的關注相對較少。通過高通量測序和可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)181個已知剪接因子中有47個在心力衰竭時上調(diào)。有趣的是，沒有觀察到剪接因子的顯著下調(diào)[2]。

RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)參與RNA代謝的各個方面，包括剪接、轉(zhuǎn)運、翻譯和穩(wěn)定性[3]。任何特定的RBP與其底物的相互作用都是由RBP中的特定序列決定的，例如RNA識別基序、RNA結(jié)合基序、核糖核蛋白基序、富含精氨酸的基序、冷休克結(jié)構(gòu)域[4]和精氨酸-甘氨酸-甘氨酸盒等，而大多數(shù)RBP有多個RNA結(jié)合序列，這反映了一個蛋白質(zhì)與多種RNA分子結(jié)合的能力。RNA結(jié)合基序蛋白(RNA binding motif protein, RBM)，即RBM家族，由雨果基因命名委員會命名，均含有RNA識別基序、RNA結(jié)合基序以及核糖核蛋白基序；近年來的研究發(fā)現(xiàn)，RBM家族成員及其介導的可變剪接在一些疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，包括各種原因引起的心力衰竭。RBM家族成員介導的可變剪接與心肌疾病乃至心力衰竭相關研究目前主要集中在RNA結(jié)合基序蛋白20、24和25。

2 RBM20介導肌聯(lián)蛋白的可變剪接

編碼RBM20的RBM20基因已被初步鑒定為擴張性心肌病(dilated cardiomyopathy， DCM)的連鎖基因之一[5]。RBM20是脊椎動物特有的RNA結(jié)合蛋白，由1 227個氨基酸殘基組成，作為剪接因子相對較大，但它只有3個保守的可識別功能結(jié)構(gòu)域：兩個鋅指結(jié)構(gòu)域和一個RNA識別基序型RNA結(jié)合域[6]。其在心臟和骨骼肌中高度表達，在2%～3%的家族性和散發(fā)性DCM病例中發(fā)現(xiàn)了RBM20基因異常[7]。對RBM20敲除的大鼠及存在和不存在RBM20突變的人類DCM患者的心臟轉(zhuǎn)錄本進行高通量RNA測序(RNA-seq)共發(fā)現(xiàn)了31個基因，這些基因的可變剪接在大鼠和人類中均依賴于RBM20。RBM20主要通過與目標外顯子的上游和/或下游的內(nèi)含子結(jié)合來抑制盒式外顯子，包括TTN (Titin)和Ryr2基因中的那些外顯子。相互排斥的外顯子也在RBM20目標外顯子中富集。例如，RBM20抑制外顯子15和16，并促進編碼鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ-δ(CaMKⅡ-δ)的CAMK2D基因中的外顯子14。

RBM20是心臟特異性TTN pre-mRNA剪接的主要調(diào)控因子。在人類心力衰竭隊列中，內(nèi)源性RBM20的低表達與TTN基因的剪接模式相關。肌節(jié)是促進橫紋肌收縮的基本結(jié)構(gòu)單位。肌聯(lián)蛋白(TTN)是肌節(jié)的一個重要組成部分。在結(jié)構(gòu)上，TTN起著生物彈簧的作用，橫跨肌節(jié)的一半，并將Z盤連接到M線上。心肌細胞中基于TTN的被動張力占據(jù)了整個心肌的很大比例。它與TTN彈簧區(qū)的分子質(zhì)量或氨基酸序列長度呈負相關。例如，在心肌中，有兩種主要的肌動蛋白亞型表達：較短的N2B亞型只包含可變區(qū)中的N2B特有元件；較長的N2BA亞型含有N2B和N2A特有的元件以及可變長度的中間Ig重復結(jié)構(gòu)域，與N2BA相比，N2B具有更短的彈性區(qū)域[8]，因此給予心肌細胞更高的被動張力。因此，人們認為肌動蛋白亞型的比例以及肌動蛋白的總量影響心肌被動張力[9]。N2B亞型與N2BA亞型的比例在不同的物種間及心房心室之間均不同，在發(fā)育過程中也是動態(tài)調(diào)節(jié)的。在擴張型心肌病心力衰竭、射血分數(shù)降低的心力衰竭和慢性缺血性心肌病中，N2BA亞型的數(shù)量增加[10]，而在高血壓心臟病引起的舒張功能障礙中觀察到N2BA亞型的減少。

在動物模型中，通過操縱TTN Pre-mRNA剪接來提高TTN的順應性，可以扭轉(zhuǎn)舒張功能障礙，從而TTN剪接調(diào)控因子RBM20可以作為潛在的治療靶點。利用RBM20敏感的TTN剪接報告進行了小分子化合物的高通量篩選證明卡烯內(nèi)酯部分地通過降低培養(yǎng)細胞中RBM20的蛋白水平來抑制RBM20介導的TTN外顯子的抑制[11]。

3 RBM24異常剪接引起心肌發(fā)育障礙

RBM24是一個進化上保守的RBP，在其N-末端含有一個RNA結(jié)合基序。近年來的研究使它成為細胞分化的重要調(diào)節(jié)因子和與人類疾病有關的潛在因子。雖然到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)人類RBM24基因突變與任何疾病有關，但其表達水平的不足可能與心肌疾病密切相關，在不同的動物模型中已經(jīng)證明了該基因的關鍵作用。研究暗示脊椎動物的RBM24似乎參與了幾乎所有方面的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。重要的是，在心肌和骨骼肌中，它是調(diào)節(jié)選擇性剪接以建立收縮功能的關鍵因素[12-14]。

剪接因子RBM24控制著大量的肌肉特異性剪接事件[15]。小鼠體內(nèi)RBM24的靶向失活擾亂了心臟發(fā)育，并導致胚胎在13.5 d左右死亡。這些胚胎顯示出多種心臟畸形，例如室間隔缺損，以及室壁的小梁減少和增加。然而，最引人注目的觀察是在突變的心肌細胞中肌節(jié)幾乎完全消失。這與斑馬魚的心功能喪失研究是一致的[16]， RBM24缺乏導致肌節(jié)蛋白減少，Z盤異常和心肌收縮力減弱[15]。對RBM24基因敲除小鼠心臟的RNA測序(在表型開始之前)和隨后的體外剪接分析顯示，RBM24至少控制68個剪接事件，主要是通過促進肌肉特異性外顯子的保留。一些依賴于RBM24的剪接轉(zhuǎn)錄本在心臟發(fā)育、肌節(jié)形成、肥大或擴張型心肌病中發(fā)揮關鍵作用。與心臟生物學相關的RBM24剪接靶基因包括Naca[16]、Fxr1、Abcc9、Slc25a3、Usp25和Usp28。然而RBM24敲除小鼠的胚胎致死性降低了其在成人心臟中的功能分析的可能。因此，為了闡明RBM24在成人心臟中調(diào)控的剪接事件，人們對RBM24條件性敲除等位基因的產(chǎn)生和分析充滿了極大的興趣。

RBM24作為關鍵的剪接調(diào)節(jié)因子對心臟早期發(fā)育必不可少幾乎已經(jīng)被明確[12, 17]。然而，出生后的心臟伴隨著重大的剪接變化。對出生后RBM24的功能進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)500多個與RBM24有關的調(diào)控不當?shù)漠悩?gòu)體開關[14]，而其中大多數(shù)在研究心臟早期發(fā)育的研究中是沒有發(fā)現(xiàn)的[12, 17]。這些異常的異構(gòu)體開關可能導致生物力學和信號通路的改變，最終導致收縮受損、心力衰竭和出生后死亡。TTN即是其中之一，RBM24促進了TTN外顯子11和13的保留，這兩個外顯子位于Z盤，參與肌原纖維的組裝、穩(wěn)定和維持。因此，RBM24基因的缺失可能導致RBM24基因缺陷小鼠Z盤內(nèi)細絲數(shù)量和分布減少，影響Z盤結(jié)構(gòu)，導致心功能不全[14]。RBM24亦可能與p53 mRNA結(jié)合并與翻譯起始因子eIF4E相互作用，通過阻止eIF4E與p53 mRNA結(jié)合并抑制翻譯起始復合物的裝配來參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[18]。

4 RBM25介導鈉通道的可變剪接可引起心臟疾病

RBM25定位于核斑點，研究強烈提示它在前體mRNA的加工過程中起作用，并且這種調(diào)節(jié)是基因特異性的。對心力衰竭患者和健康對照人的心臟樣本進行微陣列分析顯示LUC7L3和RBM25分別上調(diào)了1.7倍和1.5倍。RBM25的作用是由LUC7L3介導的，LUC7L3是一種酸中毒和低氧敏感的剪接因子，是酵母U1 snRNP相關因子的人類同源物，在mRNA前體剪接中起作用。LUC7L3有兩個鋅指結(jié)構(gòu)[19]。第一個使Pre-mRNA交聯(lián)，是LUC7L3剪接活動所必需的。LUC7L3通過其第二個鋅指在Pre-mRNA和U1 snRNP之間起橋梁作用。RBM25選擇性地與LUC7L3結(jié)合，并通過與外顯子剪接增強子順式元件CGGGCA的相互作用激活剪接，如促凋亡的Bcl-xs 5′端等。

RBM25和LUC7L3共同介導了心臟鈉通道(sodium voltage-gated channel alpha subunit 5, SCN5A) mRNA的可變剪接，進而引起一系列的心臟事件，如心力衰竭和心律失常，觀察整個SCN5A mRNA序列發(fā)現(xiàn)，在檢測到SCN5A剪接變異體的地方，RBM25只有一個結(jié)合位點[2]。凝膠電泳遷移率分析顯示，SCN5A外顯子28上的序列CGGGCA結(jié)合了RBM25，剪接調(diào)控因子的上調(diào)和下調(diào)證實了RBM25是必要的，也是足以導致SCN5A mRNA異常剪接的。事實上，心力衰竭會導致兩個SCN5A變異體的增加，分別命名為E28C(39 bp)和E28D(114 bp)，SCN5A mRNA變異是由SCN5A末端外顯子(外顯子28)的隱性剪接序列剪接引起的。與全長鈉通道相比，SCN5A變異體更短，編碼的鈉通道蛋白過早截短，沒有從結(jié)構(gòu)域Ⅳ、S3或S4到C末端的片段。

血管緊張素2(angiotensin2, Ang2)和低氧是LUC7L3/RBM25復合體上調(diào)和SCN5A mRNA剪接異常的信號。在人胚胎干細胞來源的心肌細胞(human embryonic stem cells-cardiomyocytes, hESCs-CMs)中，低氧使SCN5A變異體E28C和E28D的表達分別增加3.7倍和6.4倍，而全長SCN5A轉(zhuǎn)錄本的表達降低0.7倍。在Ang2作用下，SCN5A變異體E28C和E28D的表達分別增加2.9倍和4.3倍，而全長SCN5A轉(zhuǎn)錄本的表達降低0.8倍[2]。

這種異常的RNA剪接效應可能是由于RAS激活而導致Na+通道啟動子下調(diào)的相加作用。根據(jù)芯片分析和NF-κB亞基的過度表達顯示，Na+通道下調(diào)似乎是由p50/p65亞基與SCN5A啟動子結(jié)合介導的[20]。這種的慢性效應可能與之前報道的Ang2或氧化應激的急性效應相加，增強了Na+通道的功能障礙。因此，在與氧化應激和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)激活相關的病理生理條件下，可能會對Na+通道產(chǎn)生多種急性和慢性的有害影響。

除了NF-κB對Na+通道啟動子的直接作用外，該轉(zhuǎn)錄因子可能在可變剪接中發(fā)揮作用。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)是低氧時升高的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子。HIF-1α的啟動子含有NF-κB結(jié)合元件，NF-κB是HIF-1α激活過程中的上游調(diào)控因子[21]。其中，HIF-1α mRNA調(diào)控剪接因子LUC7L3和RBM25，提示NF-κB激活可能是心臟氧化應激、炎性反應或低氧過程中該通道選擇性剪接的上游。

5 問題與展望

雖然已經(jīng)從遺傳學上證明了某些RBM(如RBM20)的突變導致了DCM，但隨后的心臟轉(zhuǎn)錄組分析和動物模型均尚未確定RBM20所調(diào)節(jié)的其異常剪接與DCM的每一種癥狀(如收縮功能障礙、左心室擴大和室性心律失常)密切相關的基因。將最新的全長cDNA/mRNA直接測序技術應用于超長TTN轉(zhuǎn)錄本，將有助于闡明RBM依賴的異構(gòu)體的精確剪接模式，有助于理解調(diào)控機制，闡明這些機制將有助于進一步理解心臟特異的選擇性剪接調(diào)控，以及未來可能操縱RBM活性的治療方法。

高度的調(diào)控使選擇性剪接成為心臟病治療的潛在靶點。在干擾剪接的方法中，反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides, AONs)的使用備受關注[22]。AONs的設計方式是將它們綁定到特定的剪接序列以操縱剪接。是否可以通過針對可變剪接調(diào)控的靶mRNA中RBM的RNA識別元件設計的AONs來實現(xiàn)這一點將是一件值得探索和期待的事情。