基于網絡藥理學和分子對接技術預測山楂治療冠心病潛在分子機制

楊 敏，孟凡穎，孫 輝，楊柏榮，劉夢醒，陳 潔，范 奧，劉 媛?

（1. 昆明市第三人民醫院 藥學部，云南 昆明 650041；2. 云南中醫藥大學 中藥學院，云南 昆明 650500；3. 昆明市中醫醫院 藥劑科，云南 昆明 650500）

據《2020世界衛生統計報告》中顯示，心血管疾病仍是導致死亡的主要病因，自 2000年以來，全球心血管疾病死亡人數增加了四分之一，2019年達到1 790萬人[1]。冠心病（coronary heart disease，CHD）是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，我國 CHD死亡率逐年上升，其中2018年CHD在我國的死亡率高達 114（1/10萬）[2-3]。中醫歷代文獻中并無“冠心病”病名，但有類似該病的癥候記載，如《備急千金要方》中就寫道“論曰：寒氣卒客于五臟六腑，則發卒心痛胸痹”。《金匱要略》中也提到“夫脈當取太過不及，陽微陰弦即胸痹而痛，所以然者，責其極虛也。今陽虛知在上焦，所以胸痹心痛者，以其陰弦故也”。

中藥具有多成分、多靶點的特點，在心血管疾病干預中具有內在優勢。山楂是傳統的藥食兩用藥材，其功效健運脾胃，消積導滯，在CHD的治療中有廣泛的臨床應用[4]。現代藥理學研究表明，山楂可顯著降低 CHD患者血漿中同型半胱氨酸（被認為是CHD的獨立危險因素）及血脂含量[5]。同時山楂還能降低超敏C反應蛋白（頸動脈斑塊形成的獨立危險因素）及基質金屬蛋白酶的表達水平，穩定冠狀動脈粥樣硬化斑塊，提高患者存活率[6-7]。臨床研究表明山楂能改善 CHD患者的血脂及心絞痛發作癥狀，減少非急性期CHD痰瘀癥患者急性心血管事件的發生[8-9]。

然而山楂治療 CHD的作用機制研究滯后于其臨床應用，缺乏對山楂多成分-多靶點-多通路治療 CHD的整體認識。網絡藥理學從整體的角度來認識藥物與機體之間相互作用，有助于挖掘中藥多成分作用的靶點及功能通路的整體情況。本研究擬通過網絡藥理學探究其活性成分作用靶點，構建其作用網絡，并結合分子對接技術，系統闡明山楂治療CHD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 山楂的活性化合物及靶點預測

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和相關文獻收集化學成分，以“山楂”為關鍵詞檢索其化學成分。根據口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18的 2個 ADME屬性值作為活性成分篩選條件，并獲得活性成分的作用靶點。運用 Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）校正靶點蛋白名稱為規范的基因名稱。

1.2 CHD相關靶點預測

以“coronary heart disease”為關鍵詞，分別檢索 GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數據庫（http://omim.org/），獲取CHD的潛在靶點。并通過 VENNY2.1軟件構建韋恩圖，得到山楂治療CHD的靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

將山楂-CHD共同靶點傳至 STRING11.0數據庫（https://string-db.org/），構建PPI網絡模型，選擇“multiple proteins”，將生物種類設定為“Homo sapiens”進行檢索，設置為評分≥0.9，以提高生物信息的可信度，通過以上信息的處理導出PPI網絡圖。下載tsv文件，保留節點（node1，node2）和結合率評分（combine score）信息，并導入到Cytoscape 3.7.0軟件，分析靶點相關的拓撲參數，并基于degree值進行排序。

1.4 靶點GO及KEGG通路富集分析

通過Metascape數據庫（http://metascape.org/gp/index.html）對山楂治療CHD的靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，選擇各過程富集排名前10位的分析結果（P<0.01）。進行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）路富集分析，根據P值篩選顯著性高的通路，設置P<0.05，選取最顯著的10個通路。

1.5 成分-靶點-信號通路構建

基于藥物-成分-靶點-信號通路，運用Cytoscape構建藥理學網絡。根據KEGG通路富集分析的結果所選取的主要信號通路，同時與參與相關通路的靶點建立聯系，并與“成分-靶點”間相互作用關系整合并導入Cytoscape 3.7.0軟件中，從而得到成分-靶點-信號通路網絡圖。

1.6 分子對接驗證

①受體蛋白準備：從RSCB PDB數據庫中獲取核心靶點的3D結構pdb格式文件。蛋白導入Schr?dinger 2018軟件，在 Protein Preparation模塊下進行蛋白加氫、補全缺失殘基和 loops區、刪除水分子等處理；②化合物處理準備：從PubChem數據庫下載化合物3D結構的sdf格式文件，將化合物導入Schr?dinger 2018軟件，在LigPrep模塊下進行處理優化；③蛋白活性口袋準備：查找文獻找到靶點活性口袋或者用軟件進行預測，Binding Site Detection模塊下可發現、觀察、評估蛋白結合位點；④定義活性口袋和產生格點文件：在Receptor Grid Generation模塊下進行處理，生成活性口袋格點文件；⑤分子對接：選中化合物和上一步產生的格點文件，在 Lignd Docking模塊下進行分子對接。親和能越低，表明活性成分與靶蛋白的結合力越強，一般認為親和能≤–7.0 kJ/mol的藥物分子與靶點具有較好的結合活性。

2 結果與分析

2.1 山楂的活性化合物及靶點篩選

根據 ADME條件篩選得到 6個主要活性成分，見表1。通過UniProt數據庫中找出化學成分對應的靶基因名稱，物種限定為“Homo Sapiens”，去除重復的基因，獲得166個靶點。

表1 山楂活性成分信息特征表Table 1 Crataegi Fructus active ingredient information characteristic table

2.2 CHD相關靶點的獲取

檢索 GeneCards和 OMIM 數據庫，其中GeneCards數據庫設置Score值≥3.91。兩個數據庫的篩選結果刪除重復基因后得到 CHD靶點3 850個。并通過 VENNY2.1軟件取共同靶點繪制韋恩圖，得到山楂治療CHD相關靶點140個，如圖1。

圖1 山楂-冠心病共同基因靶點數Fig.1 The number of common gene targets of Crataegi Fructus-coronary heart disease

2.3 PPI網絡構建

將140個共同靶點上傳至STRING11.0數據庫進行分析，構建山楂與 CHD的靶點 PPI網絡圖。該網絡中發生蛋白相互作用的靶點有127個（其中13個靶點未發生蛋白相互作用，故剔除），包括192個節點，767條邊，平均節點度值為7.99，見圖2。運用Cytoscape 3.7.0軟件對127個靶點進行拓撲分析，其中degree值越大則節點越大，表示山楂通過此靶點治療 CHD的可能性越大。根據分析結果取degree值排名前10的靶點，依次為 JUN、AKT1、TNF、MAPK1、TP53、RELA、IL6、MAPK8、MAPK14、EGFR，推測這些靶點可能是治療冠心病的核心靶點，見圖3。

圖2 山楂與冠心病交集靶點的PPI網絡圖Fig.2 PPI network diagram of the intersection target between Crataegi Fructus and coronary heart disease

圖3 山楂治療冠心病的核心靶點Fig.3 The core target of Crataegi Fructus in the treatment of coronary heart disease

2.4 GO和KEGG通路富集結果與分析

GO富集分析結果顯示，山楂治療CHD參與的生物過程（biological process，BP）包括：對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、對無機物的反應（response to inorganic substance）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、對受傷的反應（response to wounding）、細胞對有機環狀化合物的反應（cellular response to organic cyclic compound）、血管發育（blood vessel development）等；參與的細胞組成（cellular component，CC）主要包括：膜筏（membrane raft）、轉錄調節復合體（transcription regulator complex）、質膜蛋白復合物（plasma membrane protein complex）、細胞器外膜（organelle outer membrane）等；分子功能（molecular function，MF）主要富集于轉錄因子結合（transcription factor binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、蛋白激酶結合（protein kinase binding）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、G 蛋白偶聯胺受體活性（G protein-coupled amine receptor activity）等。

KEGG通路分析結果顯示，山楂治療 CHD的靶點主要集中在癌癥通路（Pathways in cancer）、糖尿病并發癥中的 AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（Hepatitis B）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease）、NF-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）等，詳見圖5。

圖4 山楂治療冠心病靶點GO富集分析結果Fig.4 GO enrichment analysis results of Crataegi Fructus targets for the treatment of coronary heart disease

圖5 山楂治療冠心病靶點KEGG富集分析結果Fig.5 KEGG enrichment analysis results of Crataegi Fructus targets for the treatment of coronary heart disease

2.5 成分-靶點-信號通路構建

運用 Cytoscape 3.7.0軟件構建山楂活性成分-作用靶點-信號通路網絡。圖中包括山楂活性成分6個；山楂與 CHD共同靶點 127個；信號通路10條。篩選出的山楂活性成分的作用靶點分布在不同的信號通路，相互協調，通過調控不同的信號通路發揮治療CHD的作用，詳見圖6。

圖6 山楂治療冠心病的成分-靶點-信號通路Fig.6 Crataegi Fructus in the treatment of coronary heart disease components-target-signal pathway

2.6 分子對接驗證

選取degree值前10位的核心靶點與有這10個靶點的活性成分進行分子對接驗證。篩選得到異鼠李素（isorhamnetin）、山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）3個活性成分有對應核心靶點，推測這3個活性成分可能為山楂治療CHD的關鍵藥效成分。在分子對接中，親和能能值越低表示化合物與靶點蛋白結合更好，本研究篩選親和能≤–7的成分與靶點作為研究對象，由表2可知，異鼠李素、山萘酚和槲皮素均能與 MAPK8靶點結合，且親和能最低，表明MAPK8靶點可能為其關鍵靶點，見圖7。其中槲皮素與MAPK8靶點結合的親和能為–7.98，小于異鼠李素和山萘酚，槲皮素與MAPK1亦能較好的結合，表明槲皮素更易與靶點MAPK8、MAPK1靶點結合。此外異鼠李素與RELA靶點結合的親和能為–7.19，也具有較好的結合活性。

表2 山楂關鍵成分與對應核心靶點作用情況Table 2 The interaction of key components of Crataegi Fructus with corresponding core targets

圖7 核心化合物與關鍵靶點分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram of core compounds and key target molecules

3 討論

心血管疾病已成為嚴重的全球公共衛生問題，其發病率和死亡率居世界首位。CHD是最常見的心血管疾病，面對如此嚴峻的形勢，開發治療CHD的藥物已成為當務之急。CHD在中醫中多記載為“胸痹”范疇，與痰濁痹阻，氣滯血瘀等相關。現代醫學認為高脂血癥、高血壓、糖尿病等是其常見病因，可見糖脂代謝與 CHD密切相關[10]。中藥山楂既擅長治油膩食積，又擅長活性散瘀，現代藥理學研究表明山楂具有調節糖脂代謝的功效。因此，本文在中醫理論的指導下，針對傳統的藥食同源中藥山楂展開研究，為山楂治療CHD的作用機制研究提供理論基礎。

通過 TCMSP篩選出山楂活性成分為：谷甾醇（sitosterol）、山萘酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、槲皮素（quercetin）、表兒茶素（ent-Epicatechin）、異鼠李素（isorhamnetin）。將山楂活性成分靶點與 CHD靶點進行交集，得到140個共同靶點，提示了山楂治療CHD的潛在作用。對共同靶點進一步拓撲分析，取degree值前10的靶點為JUN、AKT1、TNF、MAPK1、TP53、RELA、IL6、MAPK8、MAPK14、EGFR，推測這些靶點可能是治療 CHD的核心靶點。同時KEGG富集分析結果表明，癌癥通路（Pathways in cancer）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙肝（Hepatitis B）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease）、NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）等可能是山楂治療CHD的關鍵通路。

為驗證網絡藥理學預測的準確性，選取主要活性成分與核心靶點進行分子對接，其結果表明異鼠李素（isorhamnetin）、山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）3個活性化合物與核心靶點MAPK8、MAPK1、RELA均表現出良好的親和作用，體現了中藥多成分多靶點的特性。MAPKs家族是調控炎癥基因表達的一類重要蛋白，MAPK8（mitogen-activated protein kinase 8）又被稱為c-Jun氨基末端激酶1（cJun N-terminal kinase 1，JNK1），可通過級聯反應將細胞外信號傳遞到細胞及核內，激活轉錄因子調控基因表達[11]。研究表明通過抑制p38 MAPK軸可降低CHD中內皮細胞的炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡，進而治療 CHD[12]。MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1）基因，也被稱為ERK2基因，其參與增殖、分化、轉錄調節等多種細胞進程，MAPK1基因遺傳多態性可能影響 CHD的血脂代謝和凝血功能，參與 CHD的炎性反應[13]。RELA又名p65，是NF-κB信號通路的重要成員[14]。在大鼠模型中 ac-p65和 NF-κB信號通路相關蛋白水平的降低，可緩解其CHD癥狀[15]。

槲皮素在體外具有全身和冠狀動脈血管舒張作用，并在多個高血壓模型大鼠中降低血壓，研究表明槲皮素的攝入與較低的 CHD死亡率有關。槲皮素能抑制MAPK通路上JNK、p38的磷酸化，在急性冠脈綜合征模型大鼠中，過表達miR-330通過WNT信號通路靶向MAPK8，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，同時促進血管內皮細胞增殖[16]。槲皮素可通過調控p38 MAPK/NF-κB信號通路，減輕炎癥，保護糖尿病大鼠的腎臟，緩解糖尿病[17]。這些研究支持了本文的結論。現代藥理學研究表明槲皮素還可通過阻斷HUVECs中NF-κB和AP-1信號通路抑制TNF-α誘導的細胞凋亡和炎癥反應，通過產生H2O2激活冠狀動脈中的BKCa電流促進冠脈的舒張[18-19]。本研究中未見這些通路上的靶點，也是我們后期需要繼續探究的方向。

槲皮素可以經甲基化生成異鼠李素[20]。異鼠李素通過阻斷HUVECs中NF-κB和AP-1信號通路抑制TNF-α誘導的細胞凋亡和炎癥反應，這可能是其治療 CHD的潛在機制之一[21]。異鼠李素通過調控 H9c2心肌細胞自噬及凋亡通路蛋白表達減輕心肌損傷，通過調節AKT-FOXO1信號通路有效改善胰島素抵抗Hepg2細胞[22-23]。但文獻報道中未見異鼠李素與MAPK8靶點的直接研究結果，筆者推測異鼠李素在MAPK通路上，更多的是作為槲皮素的代謝產物，參與CHD的治療。

山萘酚具抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，其攝入與較低的心血管風險呈線性相關[24]。山萘酚通過抑制ASK1/MAPK信號通路和調節氧化應激，減輕主動脈條帶化引起的心肌肥厚，心肌功能改善[25]，還可降低 AGE-RAGE/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)誘導的氧化應激和炎癥，減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷[26]。此外，研究表明其可降低細胞內活性氧水平，抗氧化應激，保護心肌細胞，其作用機制與下調 Nox4、p67phox、p47phox的表達水平相關[27]。

綜上所述，借助網絡藥理學手段探究了山楂治療 CHD的核心活性成分、關鍵靶點，通過分子對接技術驗證了其可靠性；初步揭示了山楂主要通過異鼠李素、山萘酚、槲皮素，影響MAPK8、MAPK1、RELA等關鍵靶點，調節 MAPK信號通路從而治療預防CHD。本研究結果為山楂治療CHD的臨床應用提供了理論支持，為CHD治療機制研究提供了方向。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http//lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。