GPC結合GC-MS/MS法快速測定植物油中多環芳烴

彭星星，高海軍，尹成華，劉 瑩，戴冠蘋，趙勝男，曹晶晶

（河南省糧油飼料產品質量監督檢驗中心，河南 鄭州 450004）

多環芳烴（PAHs）具有較高的毒理特性，能產生致畸性和致突變性，且能夠導致人體多器官產生腫瘤及癌變，嚴重威脅到人類的健康[1-4]。多環芳烴極易溶于脂類物質，性狀穩定、不易分解，這種特性使得植物油等樣品更容易被其附著污染，植物油作為千家萬戶的烹飪用油，其重要性毋庸置疑，因此，有效的監控植物油中多環芳烴的含量對保障人體健康具有重要意義。

目前國內外有多種方法可以對多環芳烴的含量進行測定：如高效液相色譜法[5-7]、氣相色譜質譜聯用法[9-16]、液相色譜-串聯質譜法[17]等。Ballesteros等[18]對橄欖油原油和精煉橄欖油用乙腈-正己烷混合溶液提取，以二氯甲烷為流動相進行GPC凈化后用GC-MS/MS分析測定；胡國紳[19]比較了QuEChERS和凝膠滲透色譜2種前處理技術對食用植物油中16種多環芳烴殘留量的測定。這些文獻均使用有機試劑作為提取劑對樣品中多環芳烴進行提取，然后采用 GPC凈化后上機測定，前處理過程較為繁瑣，且會造成目標物的損失，因此亟需一種簡單、快速、方便的方法對植物油中多環芳烴進行測定。

本實驗在GB/T 23213—2008《植物油中多環芳烴的測定 氣相色譜-質譜法》[20]的方法基礎上，通過減少樣品稱樣量后選擇凝膠滲透色譜直接進行凈化的方法，除去了繁瑣的提取過程，節省了前處理的時間，節約了提取試劑，同時能夠防止目標物在提取過程中產生的含量損失，并利用氣相色譜質譜聯用儀的選擇離子監測模式（SIM）進行測定，采用添加同位素到樣品中作為分析質量控制和定量測定的手段，保證了結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗方法中的植物油，包括花生油、大豆油、菜籽油，密封冷藏待測：鄭州市大潤發超市（隴海路店）。

1.2 儀器與試劑

SCION TQ/456GC型氣相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀：德國布魯克公司；GVS/U082812型全自動凝膠凈化系統：北京萊伯泰科儀器有限公司；BS2000S型，感量為0.01 g，百分之一電子分析天平、Quintix224-1CN型，感量為0.000 1 g，萬分之一電子分析天平：賽多利斯儀器（北京）有限公司；MTN-2800型水浴氮吹儀：上海旌派儀器有限公司。

萘（純度99.4%）：北京曼哈格生物科技有限公司；苊烯（純度 99.2%）、芴（純度 99.2%）、菲（純度 99.6%）、熒蒽（純度 99.2%）、屈（純度99.9%）、苯并（b）熒蒽（純度99.9%）：壇墨質檢科技股份有限公司；苊（純度99.8%）、蒽（純度99.4%）、芘（純度97.5%）、苯并（a）蒽（純度99.1%）、苯并（k）熒蒽（純度99.2%）、苯并（a）芘（純度 99.9%）、二苯并（a,h）蒽（純度99.3%）、苯并（g,h,i）苝（純度 98.9%）、氘代-菲-D10（純度98.5%）：廣州佳途科技股份有限公司；茚并（1,2,3-cd）芘（純度99.4%）、氘代-蒽-D10（純度98.9%）：DR.Ehrenstorfer公司；氘代-苯并（a）芘-D12（純度 99.4%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

環己烷、乙酸乙酯：色譜純，北京邁瑞達科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液制備

16種PAHs混標的配制方法：用萬分之一天平準確稱取適量的 16種多環芳烴標準物質分別置于100 mL容量瓶中，然后加入體積比為1∶1的乙酸乙酯環己烷混合溶液，將其定容至刻度線，放置于–20 ℃冰箱中儲存，具體濃度值如表2所示。

3種PAHs內標的配制方法：用萬分之一天平準確稱取適量 3種多環芳烴內標物質分別置于100 mL容量瓶中，然后加入體積比為1∶1的乙酸乙酯環己烷混合溶液，將其定容至刻度線，放置于–20 ℃冰箱中儲存，具體濃度值如表1所示。

標準工作溶液：用移液槍分別移取不同體積的16種多環芳烴混合標準溶液均加入40 μL內標溶液，然后用乙酸乙酯環己烷（1+1）混合溶液進行逐級稀釋制得200 μL系列混合標準工作液，渦旋混勻，待測。

1.3.2 樣品前處理方法

稱取植物油樣品1.00 g，將其放置于10 mL比色管中，加入多環芳烴內標混合溶液 80 μL，然后加入體積比為 1∶1的乙酸乙酯環己烷混合溶液，將其定容至刻度線，使用渦旋振蕩器對其進行渦旋后溶解，將渦旋混勻后的樣品混合溶液過0.45 μm有機相濾膜轉入GPC進樣管中待上機凈化。

凝膠滲透凈化系統選擇乙酸乙酯環己烷（1+1）混合溶液作為流動相，將儀器流動相的流速參數設置為4.0 mL/min，將紫外檢測波長參數設置為254 nm，進樣量設置為5 mL，在凈化過程中收集19～36 min流出液，將收集的流出液放置于 40 ℃水浴氮吹儀中吹至近干，然后用0.2 mL體積比為 1∶1的乙酸乙酯環己烷混合溶液渦旋溶解殘留物，并轉移至加入200 uL內插管的進樣瓶中，待上機測定。

1.3.3 色譜儀條件

進樣口溫度設為 300 ℃；色譜柱選擇 DB-5 MS毛細管型（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序如下所示：

1.3.4 質譜儀條件

質譜儀參數設置如表1所示。

表1 質譜儀參數設置Table 1 The parameter settings of mass spectrometer

1.4 數據分析

應用 WPS office（11.1.010463）軟件對實驗中數據進行公式擬合和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

質譜參數采取正離子模式，對16種多環芳烴目標物和3種內標物在m/z 50～500的范圍內采用Scan（全掃描模式）進樣，得到TIC圖，再使用質譜軟件中Library Search Spectrum A對化合物進行檢索定性，得到每種化合物的保留時間，采用選擇離子監測（select ion monitor, SIM）模式進樣。16種多環芳烴及3種同位素內標的特征離子與保留時間如表2所示，16種目標物和3種內標物的SIM色譜圖如圖1所示。

表2 16種多環芳烴及3種同位素內標的特征離子與保留時間Table 2 Retention times, target ions and CAS for 16 kinds of PAHs and 3 kinds of isotopic internal standard

圖1 16種多環芳烴及3種同位素內標的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of 16 kinds of PAHs and 3 kinds of isotopic internal standard

從圖1可以看出，在優化后的儀器條件下，16種多環芳烴及3種同位素內標混合標準溶液峰型較好，各化合物均完全分離。實驗選擇氣相質譜儀的SIM模式進行測定，可以滿足樣品中多環芳烴的測定要求。

2.2 凝膠滲透色譜條件的優化

凝膠滲透色譜法（GPC）又叫做排阻色譜法，可以用來去除植物油油脂等大分子雜質，從而分離出目標化合物。其分離原理是當不同分子量的多種分子同時進入色譜柱后，大分子量的分子不會進入多孔凝膠顆粒的內部，僅通過顆粒間隙，因此會率先從色譜柱中流出；分子量小的分子會通過顆粒內部，因此會較晚流出色譜柱。本研究中對凝膠滲透色譜法的優化，首要考慮因素為能夠有效地將目標化合物與雜質分離，其次是能夠得到盡可能好的回收率，最終達到滿足分析的要求。本實驗以大豆油為例對多環芳烴凝膠滲透色譜條件進行優化，空白大豆油及添加多環芳烴目標物的大豆油 GPC凈化淋洗曲線如圖2和圖3所示。

圖2 空白大豆油GPC凈化淋洗曲線Fig.2 GPC chromatograms of soybean oil

圖3 添加多環芳烴目標物的大豆油GPC凈化淋洗曲線Fig.3 GPC chromatograms of vegetable oil with PAHs compounds

由圖2和圖3比較可知0～19 min的流出液為油脂類雜質，收集19～36 min的流出液進行氮吹濃縮后上機測定，結果表明該時間段流出液即為16種多環芳烴目標物和3種內標物質，由此可見油脂類物質基體和被測物PAHs能夠很好地分離，且收集19～36 min的流出液可以保證多環芳烴能夠達到較好的回收率。

觀察圖3中19～36 min GPC凈化淋洗曲線可知，多環芳烴目標組分出峰時間可分為兩段，因此可先設置分段收集，分別收集19～28 min的流出液和28～36 min的流出液進行氮吹濃縮后上機測定，結果表明19～28 min的流出液為前十種多環芳烴，28～36 min的流出液為后六種多環芳烴，前十種多環芳烴分子量范圍是 128～228，后六種多環芳烴分子量范圍是252～276，這說明分子量較大的后六種多環芳烴出峰時間晚于分子量較小的前十種多環芳烴，這可能是由于后六種多環芳烴的空間結構小于前十種多環芳烴的緣故，因此后六種多環芳烴較晚流出。該結論表明凝膠滲透色譜并不是嚴格按照分子量大先出峰分子量小后出峰的順序，在分離多種化合物時應該采用分段收集分段測定的方法才能保證結果的準確性。

2.3 多環芳烴標準曲線方程

16種多環芳烴混標用環己烷乙酸乙酯（1+1）溶液配制成 10～200 ng/mL的梯度標液上機進行測定。測定結果采用內標法進行定量分析，其中萘、苊烯、苊、芴、菲以D10-菲為內標進行計算，蒽、熒蒽、芘、苯并（a）蒽、屈以 D10-蒽為內標進行計算，苯并（b）熒蒽、苯并（k）熒蒽、苯并（a）芘、茚并（1,2,3-cd）芘、二苯并（a,h）蒽、苯并（g,h,i）苝以D12-苯并（a）芘為內標進行計算，以各多環芳烴化合物與內標物質量濃度比（X）為橫坐標，化合物與內標物峰面積比（Y）為縱坐標，使用質譜軟件形成標準曲線，得到各多環芳烴的回歸方程。參照朱海花等[21]的方法，取 16種多環芳烴 80 μL加標水平的樣品進行分析，測定信噪比，分別以每種多環芳烴 3倍、10倍信噪比（S/N）計算檢出限和定量限，結果見表3。由表3可知，16種多環芳烴的回歸曲線方程的相關系數均大于0.990，檢出限在0.02～ 0.50 μg/kg范圍內，定量限在0.08～1.67 μg/kg范圍內。

表3 16種多環芳烴的校準曲線、相關系數、檢出限、定量限、回收率及相對標準偏差Table 3 Calibration curve, R2, limits of detection, limits of quantitation, recoveries and relative standard deviations of 16 kinds of PAHs

2.4 重復性和準確性

取同樣空白的大豆油樣品1.00 g，16種多環芳烴標液添加水平分別為20 μL、40 μL和80 μL下做加標實驗，平行進樣6次，利用6次平行數據對平均回收率和RSD進行計算。如表2所示，在添加水平為20 μL時，16種多環芳烴計算所得的平均回收率在 85.30%～103.86%范圍內，RSD為0.69%～2.93%；添加水平為40 μL時，16種多環芳烴計算所得的平均回收率在 91.08%～106.71%范圍內，RSD為 0.64%～2.74%；添加水平為80 μL時，16種多環芳烴計算所得的平均回收率在88.01%～105.87%范圍內，RSD為0.75%～2.81%。由此可見本實驗方法的重復性和準確性能夠滿足實驗中16種多環芳烴的分析測試要求。

2.5 實際樣品分析

分別采用國標方法 GB/T 23213—2008和本實驗方法對購買的植物油樣品包括花生油、大豆油、菜籽油進行測定，測定結果如表4所示。

表4 用國標方法和本方法測得花生油、大豆油及菜籽油中16種多環芳烴含量對比Table 4 Comparison of 16 PAHs in peanut oil, soybean oil and rapeseed oil measured by national standard method and this method μg/kg

由表4中結果可知，這兩種不同前處理方法測定的16種多環芳烴結果較為接近，但使用本實驗方法簡化了提取過程，節約了提取試劑，因此本方法更為簡單、快速。

3 結論

本實驗建立了GPC結合氣相色譜質譜聯用法定量檢測植物油中16種多環芳烴的方法。樣品以流速4.0 mL/min 乙酸乙酯環己烷混合溶液（1+1）作為流動相上 GPC進行凈化，分段收集上GC-MS/MS測定后發現前十種小分子量多環芳烴先出峰，后六種大分子量多環芳烴后出峰，本實驗結果與張茜[22]等研究中多環芳烴 GPC出峰順序相吻合。該結論表明凝膠滲透色譜并不是嚴格按照分子量大先出峰分子量小后出峰的順序，在分離多種化合物時應該采用分段收集分段測定的方法才能保證結果的準確性，與 GB/T 23213—2008中前處理方法相比，本方法通過將樣品稱樣量從4 g減少到1 g，采用環己烷乙酸乙酯（1+1）溶解后直接用GPC凈化的方法，除去了繁瑣的提取過程，節省了前處理的時間，節約了提取試劑，同時能夠防止目標物在提取過程中產生的含量損失，采用添加同位素到樣品中作為分析質量控制和定量測定的手段，結果表明植物油中16種多環芳烴在GC-MS/MS上色譜峰響應值與其質量濃度（10～200 ng/mL）之間線性關系良好，16種多環芳烴的相關系數均超過了 0.99，回收率高，重復性好。該方法適合批量前處理，準確度、重復性和靈敏度均可以滿足植物油中 16種多環芳烴測定的技術要求。