m6A 甲基轉移酶METTL3 和METTL14在結直腸癌中的研究進展

靳子堯，張學梅

（1.桂林醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，廣西 桂林 541199；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541001）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤之一，其死亡率占全球惡性腫瘤死亡率第4 位，在發(fā)達國家的發(fā)病率最高[1]。我國結直腸癌年均新發(fā)病例達19 萬，發(fā)病率和死亡率均為惡性腫瘤第5 位[2]。目前，結直腸癌正逐漸傾向年輕化[3]。結直腸癌發(fā)病因素復雜多樣，潛在的危險因素包括高脂飲食、肥胖、運動缺乏和微生物感染等。長期暴露于上述危險因素會影響腸道微生物群和宿主免疫，導致結直腸上皮細胞的遺傳和表觀遺傳改變，最終誘發(fā)結直腸癌[1，3]。近年來，有關N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）在結直腸癌的作用及分子機制研究逐漸深入，其有望為結直腸癌診治提供新的方向。本文主要綜述METTL3 和METTL14 在結直腸癌增殖、凋亡、侵襲轉移以及耐藥中的作用。

1 m6A 甲基化修飾

m6A 甲基化修飾是常見的RNA 甲基化修飾，發(fā)生在腺嘌呤第6 位N 原子。它是一種動態(tài)可逆性的轉錄后修飾，在mRNA 和非編碼RNA 中最為豐富。m6A 修飾主要發(fā)生在RRACH 序列（其中R=A或G，H=A，C，或U），并且在mRNA 3’-UTR 和CDS區(qū)富集明顯[4-6]。m6A 參與了RNA 代謝的多個過程，如轉錄后剪接、翻譯效率及穩(wěn)定性維持，在生長發(fā)育、學習記憶等正常生理過程中必不可少[7，8]，并且在調控機體熱休克反應甚至是腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤免疫耐藥等各方面都至關重要[9-11]。

m6A 修飾發(fā)生在RNA 轉錄后水平，受甲基轉移酶、去甲基化酶以及甲基識別蛋白共同調控。其中甲基轉移酶催化RNA 上的腺苷酸發(fā)生m6A 修飾，它是由METTL3（methyltransferase like 3）、METTL14（methyltransferase like 14）、WTAP（Wilms’tumor 1-associating protein）和KIAA1429 等多種蛋白亞基構成的復合物[12，13]。去甲基化酶的核心蛋白包括FTO（fat mass and obesity-associated protein）和ALKBH5（AlkB homolog 5），可以對發(fā)生m6A 修飾的堿基進行去甲基化修飾，這也是甲基化動態(tài)可逆性的根本原因。甲基化識別蛋白則能夠識別和結合發(fā)生m6A修飾的堿基，調控RNA 降解與穩(wěn)定、出核轉運以及翻譯效率等過程。鑒于它們的功能特點，這些蛋白被形象的稱為“書寫者（writer）”“擦除者（eraser）”“閱讀者（reader）”[14]。

研究表明[15，16]，在甲基轉移酶復合物中，METTL3主要作為催化亞基，而METTL14 則作為靶點識別區(qū)域在RNA 結合以及復合物穩(wěn)定等方面發(fā)揮作用。WTAP 作為調節(jié)亞基與METTL3/14 復合物相互作用，使其定位到富含pre-mRNA 加工因子的核斑點，并催化甲基轉移酶的活性[17]。此外，已知的甲基轉 移 酶 還 包 括VIRMA（KIAA1429）、METTL16、RBM15/15B 和ZC3H13 等[14]。

研究發(fā)現(xiàn)[18]，F(xiàn)TO 作為去甲基化酶可調節(jié)細胞內源性m6A 殘基水平，揭示了m6A 在mRNA 中的修飾是動態(tài)可逆的調控過程。這一發(fā)現(xiàn)是揭開m6A甲基化修飾真實面目的關鍵環(huán)節(jié)。另一個去甲基化酶ALKBH5 與FTO 同屬于ALKB 雙加氧酶家族，與核斑點共定位，其發(fā)揮功能作用依賴Fe（Ⅱ）和2-氧戊二酸加氧酶[19]。經典的甲基識別蛋白包含YT521-B 同源（YT521-B homologous，YTH）結構域蛋白（包括YTHDF1-3，YTHDC1 和YTHDC2）[20,21]、人胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白家族（包括IGF2BP1-3）[22]、核不均一核糖核蛋白（包括hnRNP A2/B1 和hnRNP C）[23]和eIF3 等。近年來的研究顯示[24-26]，m6A 修飾相關的writer、eraser、reader 蛋白在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，其精細的調控機制已逐漸成為新的研究熱點。

2 m6A writer 蛋白METTL3 促進結直腸癌的發(fā)生與發(fā)展

研究發(fā)現(xiàn)[27-30]，結直腸癌患者腫瘤組織中METTL3表達增加，其表達越高患者預后越差。METTL3 在轉錄后水平調節(jié)多種癌基因和抑癌基因的表達發(fā)揮促結直腸癌的增殖作用。過表達METTL3 會抑制SOCS2 并促進LGR5 啟動子活性，以維持結腸癌細胞的細胞增殖[27]。敲除METTL3 顯著抑制了結直腸癌細胞的增殖和遷移。研究表明[31]，METTL3 靶向YPEL5 m6A 修飾位點以抑制其表達，促進結直腸癌腫瘤的生長和轉移。另一方面，METTL3 通過甲基化CCNE1 mRNA 3'-UTR 的m6A 位點來穩(wěn)定其表達水平，以提高cyclin E1 蛋白表達從而促進結直腸癌細胞增殖[32]。此外，METTL3 通過m6A/IGF2BP2 依賴的方式促進PTTG3P 的表達，調控PTTG3P/YAP1 軸從而誘導結腸癌細胞增殖，促進結腸癌的進展[33]。

METTL3 還可通過影響腫瘤細胞代謝來調控結直腸癌的進展。研究證實[29]，METTL3 對GLUT1 mRNA 進行m6A 修飾，以提高其mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯水平，促進葡萄糖代謝和結直腸癌的發(fā)生。通過對m6A-GLUT1-mTORC1 軸的調控，METTL3積極的參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展，而同時抑制mTORC1 和METTL3 會對結直腸癌的治療具有累加效應。Shen C 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖攝取量高的結直腸癌患者較攝取量低的患者其METTL3 表達水平明顯增高。進一步研究證實，METTL3 與HK2 和SLC2A1（GLUT1）的3'UTR 結合，通過IGF2BP2/3 對甲基化位點的識別與結合作用使HK2 和SLC2A1（GLUT1）在結直腸癌中穩(wěn)定表達，并激活了糖酵解途徑。由此推測，靶向METTL3 可能通過影響腫瘤代謝功能從而成為治療結直腸癌的潛在有效靶點。

METTL3 不僅作用于mRNA，還可以調控miRNA、LncRNA 和circRNA 的表達或受其調控，以介導結直腸癌的惡性進展。有研究發(fā)現(xiàn)，METTL3 通過介導pri-miR-1246 甲基化，促進pri-miR-1246 的成熟。而miR-1246 通過負向調控SPRED2 解除其對MAPK 信號通路的抑制，從而促進結腸癌的轉移和上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）[35]。Chen C 等[36]發(fā)現(xiàn)，circ1662 在結直腸癌中發(fā)揮癌基因的作用，通過增強YAP1 的核轉運促進結直腸癌的侵襲和遷移。該實驗結果表明，circ1662 通過YAP1 抑制SMAD3 的表達以促進EMT 的發(fā)生。需要說明的是，METTL3 可以誘導circ1662 發(fā)生m6A 修飾以穩(wěn)定其表達，它是維持circ1662-YAP1-SMAD3 軸有序進展，誘發(fā)結直腸癌細胞侵襲、遷移和EMT 的關鍵因素。METTL3 介導HSF1 3'-UTR處的m6A 修飾可以由YTHDF2 識別并提高其翻譯效率，促進結直腸癌細胞增殖。然而，miR455-3p 可與METTL3 競爭性結合HSF1 3'-UTR，而β-catenin可以抑制miR455-3p 的生成，以阻斷miR455-3p 競爭性抑制METTL3 介導的m6A 修飾[37]。功能實驗表明[38]，lncRNA LINC01605 與METTL3 結合并介導SPTBN2 mRNA 的m6A 修飾，從而促進SPTBN2 的翻譯，致使結直腸癌細胞增殖和轉移能力增強，細胞凋亡能力減弱。另有研究結果顯示[39]，癌基因LINC00460 促進結直腸癌的增殖，這與它作用于IGF2BP2 和DHX9 并結合HMGA1 mRNA 的3'-UTR，從而增強HMGA1 mRNA 的穩(wěn)定性和蛋白表達有關。實際上，METTL3 介導的m6A 修飾對LINC00460/IGF2BP2/DHX9-HMGA1 軸的調控發(fā)揮至關重要的作用。LINC00460 介導METTL3 對HMGA1 mRNA 的m6A 修飾以增強HMGA1 在結直腸癌中的表達，進而誘導結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。沉默METTL3 有效逆轉了LINC00460 對HMGA1 表達的正向調控及促癌作用[39]。

總之，METTL3 以m6A 修飾的方式調控多種靶分子的表達和功能作用以影響結直腸癌細胞增殖、凋亡、代謝及侵襲轉移能力。因此，特異性靶向METTL3 在結直腸癌治療中具有重要的應用前景。

3 m6A writer 蛋白METTL14 抑制結直腸癌的進展

METTL14 在結直腸癌中的表達水平與METTL3相反，在結直腸癌中低表達。METTL14 表達越高患者總生存期越長，且過表達METTL14 能夠抑制結直腸癌細胞的遷移、侵襲和轉移[40，41]。研究證實[42]，敲除METTL14 能夠降低其下游靶點SOX4 的m6A 修飾，導致YTHDF2 識別被修飾的SOX4 mRNA 作用減弱，因此提高了SOX4 的基因表達，促進了SOX4 介導的EMT 過程和PI3K/AKT 信號通路的活性，致使結直腸癌發(fā)生惡性進展。Wang S 等[43]發(fā)現(xiàn)，沉默METTL14 表達促進了結直腸癌細胞侵襲和遷移，而腫瘤轉移相關基因MeCP2 對METTL14 的結合作用增強了其對KLF4 mRNA 的m6A 修飾，并通過IGF2BP2 識別該修飾位點使KLF4 mRNA 穩(wěn)定性增強，表達水平增加，調節(jié)結直腸癌細胞的轉移。METTL14 同樣可以通過影響miRNA 和lncRNA 參與結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[41]，METTL14促進primiR-375 發(fā)生m6A 修飾，并依賴DGCR8 促進premiR-375 的表達與成熟，而后表達增加的miR-375 分別靶向YAP1 和SP1 以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲與轉移。敲除METTL14 則降低了lncRNA XIST 的m6A 水平，減少了YTHDF2 對XIST 的識別和降解作用，促進了XIST 的表達和結直腸癌細胞的增殖和侵襲[44]。

腫瘤相關巨噬細胞（tumor -associated macrophage，TAM）可以抑制T 細胞的抗腫瘤活性，但機制尚不明確。近期研究發(fā)現(xiàn)[45]，結直腸癌患者腫瘤組織中METTL14 的表達水平與CD8+T 細胞浸潤呈負相關。TAM 亞群C1q+細胞中METTL14 的表達水平降低，可以促進結腸癌細胞生長并阻礙CD8+T細胞浸潤。進一步發(fā)現(xiàn)，C1q+細胞中的Ebi3 表達水平降低可以恢復CD8+T 細胞的抗腫瘤殺傷能力，而METTL14 表達缺失可以降低C1q+細胞Ebi3 mRNA的m6A 修飾水平，并促進其轉錄水平增高。因此，提高TAM 亞群C1q+細胞中METTL14 的表達可以通過介導Ebi3 的m6A 修飾促進CD8+T 細胞的浸潤和抗腫瘤作用[45]。

4 m6A writer 蛋白METTL3 和METTL14 參與結直腸癌耐藥的發(fā)生

化療、靶向治療和免疫治療顯著改善了腫瘤患者的治療狀況。然而，在化療過程中癌細胞獲得耐藥性是治療面臨的主要挑戰(zhàn)，這極大的限制了癌癥的治療效果，嚴重影響患者的生存狀況。研究顯示[46]，Sec62 在化療耐藥的結直腸癌組織中高表達，并通過維持腫瘤細胞的干性誘導耐藥。機制研究發(fā)現(xiàn)，Sec62 特異性結合β-catenin，通過抑制其泛素化降解以穩(wěn)定β-catenin 從而活化Wnt 信號通路。更重要的是，METTL3 介導的Sec62 m6A 修飾是Sec62表達上調的關鍵環(huán)節(jié)。敲除METTL3 減少了Sec62 mRNA 的m6A 修飾及穩(wěn)定性，同時也降低了Sec62 mRNA 和蛋白水平，進而維持了腫瘤細胞的干性，促進化療耐藥。這一過程依賴于識別蛋白IGF2BP1 結合和穩(wěn)定m6A 修飾的Sec62 mRNA[46]。數(shù)據(jù)表明[47]，LBX2-AS1 能驅動結直腸癌細胞對5-FU 產生耐藥，而METTL3 誘導lncRNA LBX2-AS1 發(fā)生m6A甲基化是LBX2-AS1 在結直腸癌中高表達的重要原因。METTL3 還可以通過介導CBX8 mRNA m6A修飾參與調節(jié)結直腸腫瘤干性和化療敏感性。研究發(fā)現(xiàn)[48]，CBX8 能維持結直腸癌細胞的干性特征，并抑制結直腸癌細胞對抗腫瘤藥奧沙利鉑（L-OHP）和伊立替康（CPT-11）的敏感性。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，CBX8 通過與KMT2b 和PolⅡ相互作用促進LGR5 的轉錄和表達，而誘導CBX8 異常表達增加的機制與METTL3 介導的m6A 修飾密切有關。在結直腸癌中敲除METTL3 的表達顯著抑制了CBX8 mRNA m6A 甲基化水平，導致CBX8 mRNA 穩(wěn)定性降低。結合RMBase 預測和RIP 分析可知，IGF2BP1 和CBX8 mRNA 相互作用，增強了CBX8 的穩(wěn)定性并使其表達上調，最終誘導了結直腸癌細胞的耐藥[48]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)[49]，p53 R273H 突變的結腸癌細胞中m6A 甲基化水平升高，并且其與阿霉素耐藥相關。進一步的研究提示，鞘糖脂Gb3 介導β-catenin信號通路可以上調METTL3，而METTL3 介導的m6A 修飾決定了p53 R273H 突變蛋白的表達水平及腫瘤耐藥。過表達METTL3 促進了p53 pre-mRNAm6A 甲基化形成，增強了p53 R273H 突變蛋白的表達量，導致結直腸癌細胞對多種化療藥物耐藥。反之，沉默METTL3 表達能恢復腫瘤細胞對治療的敏感性，促進腫瘤細胞凋亡，從而改善腫瘤的治療效果。該研究提示，抑制METTL3 介導的m6A-RNA 甲基化可能是靶向TP53 R273H 錯義突變的一種特異而高效的方法。

近年研究顯示[50]，腫瘤細胞耐藥與腫瘤微環(huán)境中的TAM 密切相關。奧沙利鉑作為治療結直腸癌的一線化療藥物被廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)，TAM 通過METTL3 介導的TRAF5 m6A 修飾促進結直腸癌對奧沙利鉑的耐藥。相比奧沙利鉑敏感患者，耐藥患者的結直腸癌組織中TAM 浸潤明顯增多，同時m6A修飾水平及METTL3 的表達量均增加。極化成M2型的TAM 通過增強METTL3 對TRAF5 的m6A 修飾促進其降解從而抑制了腫瘤壞死并激活了腫瘤細胞發(fā)生奧沙利鉑耐藥[51]。因此，靶向M2 型TAM 中的METTL3 可能是恢復結直腸癌患者對奧沙利鉑敏感性的重要途徑。

阻斷程序性細胞死亡-1（programmed cell death receptor-1，PD-1）檢查點的免疫治療已在臨床中取得了較好的療效。然而，大部分結直腸癌患者對抗PD-1 抗體治療耐藥。原因在于超過4/5 的結直腸癌中無錯配修復蛋白缺失或者低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定，這類患者的腫瘤細胞突變負荷低，對免疫治療的反應和效果不理想。Wang L 等[52]研究顯示，沉默METTL3或METTL14 的表達能增強結直腸癌細胞對抗PD-1抗體治療的敏感性，這與敲除METTL3 或METTL14的表達后促進CD8+T 在腫瘤中的浸潤并增強其對腫瘤細胞的殺傷作用有關。機制分析證實，METTL3或METTL14 的缺失使Stat1 和Irf1 mRNA m6A 修飾減少，削弱了YTHDF2 對Stat1 和Irf1 mRNA 的降解作用，進而促進了Stat1 和Irf1 mRNA 的穩(wěn)定和表達增加，誘導IFN-c-Stat1-Irf1 信號傳導。因此，METTL3 或METTL14 缺失通過抑制m6A 修飾，增強無錯配修復蛋白缺失或者低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結直腸癌細胞對抗PD-1 抗體的治療效果，可以作為抗癌免疫治療耐藥的潛在分子靶點。

METTL3 和METTL14 介導m6A 修飾通過多途徑參與結直腸癌耐藥的發(fā)生。對METTL3 和METTL14 驅動的耐藥模式的深入了解可以促進新型靶向抗腫瘤藥物的開發(fā)，以提高結直腸癌治療的療效。

5 總結與展望

迄今為止，針對結直腸癌的治療方法仍然非常有限。基于高通量測序、蛋白質組學等實驗技術的快速發(fā)展為深入研究m6A 修飾在結直腸癌中的機理作用提供了更多的可能性。METTL3 與METTL14形成異二聚體作為甲基轉移酶復合物的支架發(fā)揮催化m6A 甲基化修飾的核心作用，調控了結直腸癌的增殖、凋亡、侵襲轉移與耐藥等多個生物學過程。但是m6A 修飾在結直腸癌中的分子機制作用仍然存在一些問題。例如METTL3 和METTL14 在結直腸癌增殖和侵襲轉移方面的功能作用截然相反，如何針對兩者設計和制定行之有效的靶點藥物值得綜合考慮。因此，需要明確在結直腸癌中兩者發(fā)揮功能的主次關系以及兩者之間如何相互調控；其次，影響結直腸癌發(fā)生發(fā)展的因素錯綜復雜，m6A 修飾是否影響腸道發(fā)育、腸上皮細胞的代謝和吸收，以及腸道菌群的變化等需要更多的研究進行證實。

總之，METTL3 與METTL14 作為靶點分子在結直腸癌治療中具有重要作用，但對于其在結直腸癌癥中的作用機制仍需要進一步探索。