長鏈非編碼RNA 相關的競爭性內源性RNA 網絡中結腸腺癌潛在生物標志物的研究進展

童曼曼，劉熙稱，孫曉宇，何行

吉林大學第一醫院急診科，長春 130021

近年來，非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）是惡性腫瘤研究領域的熱點，ncRNA沒有編碼蛋白質的能力，主要包括核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉運RNA（transfer RNA，tRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。它們的共同特征是從基因組轉錄而來，但是卻不能翻譯成蛋白質，僅能在RNA水平上發揮其生物學功能。研究證實，ncRNA在腫瘤發生和發展過程中發揮重要作用，尤其是miRNA和lncRNA，其多樣性及復雜的作用機制與惡性腫瘤密切相關[1]。miRNA是內源性小分子RNA，通過與靶mRNA結合來調節蛋白質的表達。lncRNA具有200多個核苷酸，廣泛分布于基因組中，是潛在的腫瘤治療靶標和生物標志物。2011年Salmena等[2]首次提出了競爭性內源性 RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）假說，該假說提出了一種新型的大規模調節性RNA網絡，該網絡通過轉錄組中的miRNA反應元件在mRNA和ncRNA之間相互影響。隨后幾年，該假說得到了許多后續實驗證據的不斷支持。在ceRNA網絡中，lncRNA的作用是通過影響miRNA參與細胞生物學調控，從而在腫瘤發生發展中起到關鍵作用。結腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）是結腸癌的一種亞型，是全世界惡性腫瘤相關死亡原因的第一名，結腸癌的發病率和病死率均逐年增加，盡早發現結腸癌尤為重要，盡管腸鏡檢查是結腸癌早期診斷的最可靠方法，但有創性和不適感限制了其廣泛使用[3]。因此，尋找早期診斷COAD的準確且無創的生物標志物意義重大。COAD的預后評估有助于優化治療方案的選擇，因此，尋找新的生物標志物，并研究COAD發生發展的分子機制具有重要意義。本文對COAD中充當ceRNA的lncRNA進行綜述，以期能夠探索COAD遺傳層面的分子機制和開發新的生物標志物及治療靶標，為COAD的治療和藥物設計提供新的線索。

1 早期COAD 的潛在生物標志物

Liu等[4]研究納入3例早期COAD患者和3例結腸上皮內瘤變患者，并構建DEmiRNADElncRNA-DEmRNA共表達網絡，通過RNA測序獲得了5個具有早期潛在診斷價值的差異表達的lncRNA（differentiallyexpressedlncRNA，DElncRNA）：ELFN1反義 RNA1（ELFN1 antisense RNA 1，ELFN1-AS1）、長基因間非蛋白編碼RNA 1234（long intergenic non-protein coding RNA 1234，LINC01234）、小核RNA宿主基因17（small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17）、尿路上皮癌相關蛋 白 1（urothelial cancer associated 1，UCA1）和LOC101929549。該研究發現，miRNA-153-3p-SNHG17-Ⅺ型膠原蛋白α1鏈（collagen typeⅪalpha 1 chain，COL11A1）/胰島素樣生長因子結合蛋白3（insulin like growth factorbinding protein 3，IGFBP3）/KLF 轉錄因子 6（KLF transcription factor 6，KLF6）相互作用在早期COAD中起重要作用。

miRNA-153能夠通過誘導基質金屬蛋白酶9（與結腸癌轉移相關的效應物）的產生間接促進結腸癌細胞侵襲，在DElncRNA-DEmiRNA共表達網絡中，SNHG17與miRNA-153-3p在早期COAD中共表達。COL11A1編碼Ⅺ型膠原（一種次要纖維狀膠原）的兩個α鏈之一，前膠原11A1是COL11A1的主要產物，COAD基質細胞中COL11A1表達上調，而前膠原11A1的表達上調與淋巴結受累和COAD遠處轉移有關[5]。IGFBP3是胰島素樣生長因子結合蛋白（insulin like growth factor binding protein，IGFBP）家族成員，該家族可調節胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）的表達并與轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）相互作用，IGFBP3缺失后可通過抑制p53依賴性細胞凋亡促進COAD的發展。KLF6是一種鋅指轉錄因子，其表達缺失是結腸癌中的常見事件和早期事件，可通過上調細胞周期抑制劑p21的表達抑制腫瘤細胞增殖。

除SNHG17外，早期COAD中的3個DElncRNA（ELFN1-AS1、UCA1和LINC01234）也與COL11A1、IGFBP3和KLF6共表達，通過調節這些結腸癌相關基因的表達參與早期COAD的進展[4]。ELFN1-AS1是與KLF6和N-乙酰半乳糖胺基轉移酶（N-acetylgalactosaminyl transferase，GALNT）8共 表 達 的DElncRNA，更值得關注的是其可作為早期COAD中DElncRNA-DEmRNA共表達網絡和DEmiRNADElncRNA-DEmRNA相互作用網絡的中樞lncRNA。GALNT引起的糖基化異常是人類惡性腫瘤中發生的病理現象，GALNT8作為GALNT成員，在早期COAD中表達下調[6]。

UCA1可通過促進腫瘤細胞增殖在結直腸癌的發生發展中發揮關鍵作用，結直腸癌中可觀察到UCA1表達上調，提示其對結直腸癌具有潛在的診斷價值。UCA1表達水平還與大腸癌患者的腫瘤大小、浸潤深度和預后密切相關。此外，UCA1和LINC01234還是早期COAD中最先上調的兩個DElncRNA。而LINC01234和SNHG17則是DEmiRNA-DElncRNA-DEmRNA相互作用網絡中的兩個中樞lncRNA。LOC101929549通過順式調節GALNT8和KLF6的表達在COAD中發揮重要作用。

2 COAD 預后的潛在生物標志物

Zhang等[7]從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中提取關鍵數據，分析生物學過程中COAD特異性mRNA的表達，通過構建COAD特異性mRNA、miRNA和lncRNA的ceRNA網絡，進一步分析涉及lncRNA的COAD表達模式與臨床特征之間的相關性，最終證實了3種與某些臨床特征相關的lncRNA[長基因間非蛋白編碼 RNA 335（long intergenic non-protein coding RNA 355，LINC00355）、肝細胞癌上調的長鏈非編碼RNA（hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA，HULC）和IGF2反義RNA（IGF2 antisense RNA，IGF2-AS）]，確定了4種與總生存期（overall survival，OS）呈負相關的lncRNA[HOX 轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、LINC00355、KCNQ1反義鏈/反義轉錄 1（KCNQ1 opposite strand/antisense transcript 1，KCNQ1OT1）和TSSC1內含子轉錄本1（TSSC1 intronic transcript 1，TSSC1-IT1）]，并且這4種lncRNA主要集中在絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）途徑中。通過對lncRNA與直腸癌關鍵臨床特征進行分析，結果發現，LINC00355與腫瘤分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，HULC與腫瘤分期和淋巴結轉移有關，而IGF2-AS與遠處轉移有關。

HULC能夠與zeste2多梳抑制復合物2亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）相互作用，通過表觀遺傳調控抑制結直腸癌細胞中裸角質層2（naked cuticle 2，NKD2）的表達，從而促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲并誘導腫瘤細胞凋亡。NKD2是裸角質層（naked cuticle，NKD）家族成員之一，經常被甲基化，并通過充當WNT信號的負調節劑，抑制腫瘤生長和轉移。HULC在結直腸癌中過表達，其水平升高與預后不良和生存期縮短有關，而敲除HULC會在體外促進腫瘤細胞凋亡，并在體內抑制結直腸癌細胞的致瘤性。

LINC00355不僅有助于ceRNA網絡的調控，而且在結直腸癌多個病理階段中其表達均表現出顯著變化，LINC00355被認為是有希望的結直腸癌治療靶標[8]。IGF2-AS是針對IGF2的反義lncRNA，并已被證實可促進丙型肝炎病毒的復制。IGF2的過表達是結直腸癌發生的公認危險因素之一，其是腫瘤分期的標志物，也是結直腸癌發生的關鍵因素[9]。 與 癌 胚 抗 原（carcino embryonic antigen，CEA）和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）的組合相比，某些形式的RNA（如lncRNA 91H、PVT-1和MEG3）診斷早期結直腸癌的靈敏度更高，可用于結直腸癌的早期診斷[10]。

Wang等[11]全面分析了COAD中蛋白質編碼和非編碼RNA的測序數據，所構建的COAD特異性ceRNA網絡突出強調了KCNQ1OT1-hsa-miRNA-183-程序性死亡受體 4（programmed cell death 4，PDCD4）、KCNQ1OT1-hsa-miRNA-424-原肌球蛋白2β（tropomyosin 2 beta，TPM2）、HOTAIR-hsa-miRNA-143-纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor 1，SERPINE1）之間的相互作用。KCNQ1OT1是KCNQ1基因的反義分子，其在結直腸癌中的轉錄頻率很高，并且通過與β-聯蛋白（βcatenin）結合促進KCNQ1OT1啟動。miRNA-183通過降解ATP結合盒轉運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）促進結腸癌細胞增殖并抑制其凋亡，還可以通過結合其3'非翻譯區（untranslated region，UTR）調節早期生長反應因子1（early growth response factor 1，EGR1）和磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達，miRNA-183-EGR1-PTEN失調是結腸癌發生的關鍵。此外，miRNA-21還可通過靶向PDCD4促進結直腸癌細胞轉移。KCNQ1OT1過表達可促進miRNA-183表達，從而導致PDCD4表達下調，這可能是COAD發展的重要機制。

TPM2在結腸癌中通常被異常的DNA甲基化沉默，其下調與結腸癌中RhoA激活和腫瘤細胞增殖相關。HOTAIR是一種經過充分研究的lncRNA，已被廣泛報道是多種惡性腫瘤的致癌分子，通過上調結直腸腺癌中miRNA-93的表達和下調自噬相關蛋白12（autophagy related 12，ATG12）的表達，降低細胞活力，促進細胞凋亡并抑制細胞自噬，與結直腸癌轉移和預后不良顯著相關。此外，HOTAIR敲除還可通過調節miRNA-93/ATG12通路增強放療敏感性，是放療抗性的關鍵調節劑和潛在的生物標志物[12]。

SERPINE1基因在大腸癌和高度增殖的結腸癌細胞系中表達增加，并且與腫瘤的侵襲性有關。miRNA-143可以調節結直腸腺癌細胞增殖和凋亡，miRNA-143被lncRNA HOTAIR上調并靶向lncRNA HOTAIR，而SERPINE1被miRNA-143上調并靶向miRNA-143，證明HOTAIR-miRNA-143-SERPINE1相互作用可能是COAD發展的另一重要機制。Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子26（encoding Rho guanine nucleotide exchange factor 26，ARHGEF26）-AS1是編碼ARHGEF26的反義RNA，可以影響白細胞的跨內皮遷移，重要的是ARHGEF26-AS1可以被miRNA-143下調，提示ARHGEF26-AS1和相關網絡可能在COAD中發揮重要作用[11]。

3 COAD 復發的潛在生物標志物

Chen等[13]通過建立用于預測COAD復發的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網絡，鑒定出5種用于預測COAD復發的生物標志物[癌易感性候選基 因 2（cancer susceptibility candidate 2，CASC2）、AL078459.1、AL390066.1、STK4 反義 RNA1（STK4 antisense RNA1，STK4-AS1）和HOXA簇反義RNA3（HOXAcluster antisense RNA3，HOXA-AS3）]。

CASC2是在多種惡性腫瘤中下調的lncRNA，其表達降低與TNM分期較晚顯著相關，可通過阻止G0/G1～S期轉變并抑制體內腫瘤生長，從而抑制結腸癌細胞的體外增殖。此外，生物信息學分析表明，3種 miRNA（miRNA-18a、miRNA-18b、miRNA-4733）含有CASC2結合位點。熒光素酶實驗進一步證實了CASC2和miRNA-18a之間的相互作用。重要的是，原發性大腸癌組織中CASC2和miRNA-18a水平呈負相關。CASC2通過使miRNA-18a海綿化降低STAT3蛋白質抑制劑（protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3）的表達，從而抑制信號轉導及轉錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）下游基因的表達[14]。大腸癌組織的臨床樣本分析也支持CASC2和PIAS3之間的關系。這些結果表明，CASC2在大腸癌的發展中具有關鍵作用。另有研究發現，hsa-miRNA-21對CASC2的調控也可以促進結直腸腺癌細胞的增殖和遷移[15]。

HOXA-AS3是神經膠質瘤組織中最顯著上調的lncRNA之一，作為神經膠質瘤患者的獨立預后因素，HOXA-AS3沉默通過改變細胞周期進程和促進細胞凋亡而導致細胞增殖停滯，并抑制神經膠質瘤細胞的遷移[16]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4（serine/threonine-protein kinase 4，STK4）-AS1與腫瘤抑制因子STK4相關，而STK4的下調與結直腸癌的侵襲和遷移有關。STK4被認為是潛在的腫瘤抑制因子，不僅可作為患者預后的預測因子，還可抑制結直腸腺癌轉移，STK4表達缺失與COAD患者預后不良有關。對于lncRNA AL078459.1和AL390066.1，目前尚未在腫瘤中報道任何功能性作用。

4 未來展望

迄今為止，關于lncRNA及其相關的ceRNA網絡在COAD中價值的研究報道甚少。Yue等[17]證明長基因間非編碼RNA 152（long intergenic noncoding RNA 152，LINC00152）通過充當ceRNA來海綿化miRNA-193a-3p從而調控erb-b2受體酪氨酸激酶 4（erb-b2 receptor tyrosine kinase 4，ERBB4）的表達，與結腸癌的預后不良相關。Fang等[18]研究報道，lncRNA HNF1A-AS1通過充當ceRNA來調節miRNA-34a的表達，在結腸癌轉移中發揮癌基因的作用，可能是一種新的預后生物標志物，并可能成為結腸癌的潛在治療靶標。Su等[19]揭示lncRNA BLACAT1可以通過與EZH2結合而抑制p15的表達，并且是結直腸癌預后不良的獨立危險因素。本文通過對lncRNA相關的ceRNA網絡進行全面分析，重點關注COAD發展過程中新的潛在生物標志物和可能的治療靶點，未來需通過大規模的動物實驗及臨床研究證實這種關聯，將這種潛在的生物標志物應用于COAD的早期診斷、預后預測。

5 小結

綜上所述，COAD的診斷、治療及預后是目前臨床研究的熱點，對lncRNA相關的ceRNA網絡中COAD潛在的生物標志物進行全面分析，能夠為臨床中COAD的早期診斷、治療優化、預后評估提供一定的幫助。