終板軟骨細胞衰老在腰椎間盤退變中的研究進展

張艷琳 黃國付 鄒 璟 汪 敏 王昆秀

腰椎間盤退變(lumbar intervertebral disc degeneration, LIDD) 是多種脊柱疾病的主要原因，臨床常誘發下腰痛、肢體麻木等癥狀，其病理特征主要包括纖維環撕裂、軟骨終板結構改變和椎間盤塌陷[1]。其中軟骨終板不僅是椎間盤結構穩定的基礎，還是椎間盤進行物質交換和營養供應的重要通路，而終板軟骨細胞(endplate chondrocytes, EPCs)是終板軟骨組織內唯一細胞類型，負責分泌各種細胞外基質(extracellular matrix, ECM)以維持椎間盤正常生理功能。研究表明，EPCs衰老會導致ECM分泌減少和代謝失衡，促進軟骨終板鈣化損傷，最終加速椎間盤退變，提示EPCs衰老可能是LIDD發生、發展的重要機制[2]。

一、EPCs及其衰老概述

軟骨終板是位于椎體和椎間盤之間的薄層透明軟骨，承擔整個椎體的壓縮載荷，并通過彌散機制為椎間盤供給營養，當軟骨終板區域受損，相鄰椎間盤的營養交換能力會明顯下降。生理條件下，EPCs多成群分布于軟骨陷窩內，電鏡下觀察其表面有突起和皺褶，胞質內有大量的粗面內質網、發達的高爾基復合體以及少量線粒體[3]。正常情況下，EPCs負責合成以蛋白多糖(proteoglycan, PG)和Ⅱ型膠原為主的ECM，ECM參與組成髓核組織基質成分，并在各種合成和分解酶的作用下維持著代謝平衡。ECM中PG分子間孔徑的大小可以影響椎間盤中電溶質的分布轉運，膠原纖維與椎體上下面平行排列，又相互交叉形成具有通透性的彈力網，大量PG黏附其上，這種結構，使軟骨終板既具有高頻率的滲透交換功能，又具有抗皺縮和抗牽張能力[4]。細胞衰老作為一種應激反應，其最初目的是消除受損細胞并保持組織再生能力，然而隨著年齡增長和各種機械應力、損傷等刺激，衰老-清除-再生的程序無法完整進行，從而導致組織機能下降。EPCs衰老時會進入不可逆的細胞周期停滯狀態，此時細胞合成蛋白質能力減弱，ECM分泌減少，ECM代謝失衡及受壓鈣化，細胞自我修復能力降低，細胞增殖分化能力下降，繼而造成軟骨終板功能減弱和結構紊亂。

二、EPCs衰老機制

1.DNA損傷：真核細胞在分裂間期完成DNA分子復制和蛋白質合成，通常包括G1期、S期(DNA合成期)和G2期(蛋白質合成期)3期， 細胞衰老時細胞生長停滯于G1期而失去合成DNA和有絲分裂的能力。調控細胞周期的蛋白包括細胞周期蛋白(cyclin)、細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)和細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor, CDKI)。CDK屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前已知其家族成員有13個(CDK1～13)，其中CDK2和CDK4主要作用于G1期和S期，啟動DNA復制和誘發有絲分裂[6]。cyclin可與CDK組成蛋白激酶復合物(cyclin-CDK復合物)。CDKI屬于細胞周期的負調控因子，可分為Ink4家族和KIP家族，其中Ink4家族的p15、p16等通過與cyclin-CDK復合物結合，抑制CDK4/ CDK6激酶活性；KIP家族中的p21、p27等可單獨與CDK結合，降低cyclin-CDK復合物的活性，抑制cyclin作用，從而阻礙細胞周期正常進行[7]。DNA損傷時，細胞為修復損傷首先啟動損傷感應，通過上調p53、p21等抑制cyclin-CDK復合物的活性，使細胞周期停留在G1/S期，從而誘導細胞衰老。Hafsia等[8]研究發現，半乳糖凝集素3 (galectin-3, Gal-3)基因敲除小鼠的EPCs分解代謝、肥大標志物和凋亡因子水平均升高，而Gal-3抑制劑可以顯著提高正常小鼠EPCs的凋亡率。在此基礎上，劉巖路等[9]研究發現，Gal-3抑制劑可能通過抑制cyclin或CDK活性導致S期減少，G2期停滯，DNA合成受損，從而抑制EPCs增殖。由此可見，DNA損傷導致cyclin、CDK、CDKI等細胞周期相關蛋白表達異常，EPCs增殖分化能力降低，從而促進EPCs衰老。

2.端粒縮短：EPCs衰老的主要原因之一是端粒縮短和端粒酶的下調。端粒在防止染色體降解、融合或重組、維持染色體的穩定性和完整性以及確保遺傳信息的完整復制方面發揮著重要作用[10]。Zhu等[11]研究發現，在細胞分裂或復制過程中，傳統的DNA聚合酶無法復制線性分子的3′端，導致沿著細胞系分裂的染色體逐漸縮短，端粒磨損引起復制能力的喪失，線粒體功能障礙，繼而發生細胞衰老，這種作用機制也是EPCs細胞衰老的產生機制之一。退行性變椎間盤會出現端粒縮短，當端粒縮短增加時，端粒酶延長端粒的頻率也隨之增加，從而實現端粒長度的穩態，例如黃曉東等[12]經PCR檢測發現大齡鼠來源的EPCs端粒相對長度更短，同生理狀況的衰老相一致。

3.氧化應激：氧化應激源于促氧化和抗氧化穩態失衡，當細胞達到氧化狀態并延長時可能會出現衰老，衰老細胞中氧化蛋白質的積累和不溶性物質的形成大大降低了蛋白質水解功能，導致細胞蛋白質穩態的喪失[13]。黃曉東等[12]研究表明，衰老越明顯的EPCs，總抗氧化能力越低，抵抗過氧化損傷的能力越差。生理情況下EPCs中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生與清除處于動態平衡，當細胞受到機械刺激、高氧、高糖及炎性細胞因子等刺激時ROS的產生增加，高水平ROS的產生會造成EPCs膜脂質、蛋白質的氧化損傷以及DNA損傷，是EPCs衰老的誘導因素之一[14]。黃曉東等[12]報道稱氧化應激可以通過盤狀結構域受體通路，產生單鏈DNA損傷信號，激活共濟失調毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia mutant gene, ATM)激酶活性，促進受損DNA附近組蛋白磷酸化，上調p53/p21的活性，從而引發細胞衰老。由此可見，氧化應激損傷可以引起DNA損傷，從而誘發EPCs衰老。

4.SASP紊亂：EPCs衰老除了經歷細胞周期生長停滯之外，還分泌大量炎性細胞因子和基質蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)，包括MMP-1、MMP-3和MMP-10等蛋白，以及其他細胞因子和生長因子，這一特征稱為衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)，其中炎性細胞因子IL-6 和 IL-8可以促進慢性炎癥、驅動衰老并增加與年齡相關病變的風險[15]。SASP可以對鄰近EPCs和ECM產生分解代謝作用，導致軟骨終板結構和功能的破壞。張樹文等[16]在衰老EPCs中觀察到MMP和PG水解酶水平升高。由此可見， EPCs細胞內存在不平衡的基質代謝穩態，即合成代謝減少和分解代謝增加，是EPCs衰老的原因之一。

5.自噬抑制：在EPCs衰老機制中，細胞自噬是不可或缺的一部分。細胞自噬通過雙膜結合液泡隔離細胞質成分形成自噬體，自噬體膜的啟動、延伸、成熟及其與溶酶體的融合由不同的自噬相關蛋白介導，自噬體的形成隨自噬相關蛋白的整體下降而減少。研究表明，EPCs自噬與衰老密切相關，激活自噬可以相對延緩EPCs衰老，促進細胞增殖生化過程[17]。例如Liang等[18]研究發現，姜黃素可以通過誘導自噬來保護EPCs，增強自噬在一定程度上可以減輕EPCs退化，而具有自噬抑制性的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase /protein kinase B, PI3K/Akt)信號通路參與抑制EPCs的活性，并誘導細胞衰老與凋亡。

三、EPCs衰老對LIDD的影響

不同程度的EPCs衰老引起EPCs功能異常，包括ECM合成分泌減少、膠原結構改變、終板基質滲透作用減弱等，久而久之軟骨終板鈣化出現裂隙，結構紊亂致使終板功能缺失。椎間盤屬于無血運組織，其所需營養主要依賴終板途徑，軟骨終板功能受損造成營養通道阻塞，椎間盤的物質交換能力明顯下降，髓核血供及營養減少，髓核內源性修復失敗而發生變性，最終椎間盤功能減弱，導致LIDD的發生和進展。相關數據顯示，退變的椎間盤內，由于EPCs密度迅速降低，PG和Ⅱ型膠原的分泌減少，使得椎間盤基質中滲透壓下降和水分子損失，椎間盤抗壓能力和機械性能降低，最終導致椎間盤退變加速[5]。因此，闡明EPCs衰老機制對揭示LIDD發生、發展機制至關重要，有助于尋求防治LIDD的有效干預措施。

四、通過抗EPCs衰老調控LIDD進程

1.調控細胞周期相關蛋白表達通路：不同的細胞周期相關蛋白形成不同的信號通路參與調控EPCs衰老和LIDD，通過激活或抑制相關通路可以調控LIDD進程，常見的信號通路包括p21、p53、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase, p38MAPK)和Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)等信號通路[19]。例如周年等[20]通過建立人體外EPCs衰老模型，發現過表達信息調節因子2同源蛋白1(sirt1)通過抑制p53/p21信號通路，來抑制白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)介導的EPCs衰老，從而減緩LIDD發展。張宇等[21]研究證實，羥基紅花黃素A能夠通過下調p53蛋白表達來抑制EPCs衰老，從而延緩LIDD進程。柳根哲等[22]研究表明，益氣活血湯可通過調控p38MAPK信號通路，下調大鼠椎間盤退變終板軟骨中相關mRNA與蛋白表達，抑制EPCs凋亡，從而延緩椎間盤退變。

2.激活端粒酶活性：端粒酶能夠恢復丟失的端粒DNA以減緩端粒的不斷縮短，從而保護自身遺傳信息，通過調節端粒酶活性，可以保護EPCs免受端粒磨損，減緩EPCs衰老，進而調控LIDD進程。端粒酶活性主要由端粒酶催化亞基(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)表達水平的高低決定。周榮平等[23]將hTRT基因腺病毒載體導入椎間盤細胞內發現，hTRT基因能夠通過抑制椎間盤組織和細胞中PG以及Ⅱ型膠原的減少，有效阻抑椎間盤EPCs衰老以及LIDD。基于端粒酶的抗衰老策略，主要包括化學端粒酶激活劑、端粒酶表達激活劑和端粒酶基因治療，未來有望通過慢病毒載體等細胞療法，調控端粒酶活性，減少端粒縮短，來實現延緩EPCs衰老、減輕LIDD的目的[24]。

3.抗氧化損傷：ROS可以參與激活多種信號通路，如核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、p38MAPK、p53等信號通路，通過上調ECM降解酶和促炎性細胞因子，下調ECM合成代謝的基因，影響MMP、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和PG等多種蛋白表達，從而調節EPCs的自噬、衰老與凋亡[25]。例如Zhou等[26]研究表明，促氧化劑H2O2誘導的氧化應激激活了p53/p21 通路，導致EPCs衰老。并且Yang等[27]研究發現，H2O2和IL-1β均可以使EPCs中PG和Ⅱ型膠原蛋白的 mRNA 水平降低，而抗氧化劑谷胱甘肽可以有效防止這種有害作用。這表明谷胱甘肽等抗氧化劑可以通過減輕氧化應激損傷導致的EPCs衰老，保護椎間盤結構和功能正常，而成為治療LIDD的一種可行性選擇。

4.維持SASP穩態:參與組成SASP的信號通路蛋白有NF-κB、p38MAPK、IL-1β等，通過激活或抑制相關信號通路，可以調控SASP的分泌表達，消除炎性細胞因子對EPCs的損害，進而保護終板軟骨，有望成為治療LIDD的手段之一。NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，它參與機體的炎性反應、免疫應答，能調節細胞凋亡、應激反應，控制DNA轉錄、細胞因子產生和細胞存活。Ngo等[28]研究發現，DNA損傷時上游p38MAPK通路通過激活NF-κB的轉錄活性，調節SASP的表達和分泌，促進IL-6、IL-8和TNF-α的表達。王剛良等[29]研究發現，石蒜堿能夠通過阻斷EPCs內IL-1β誘導的NF-κB信號通路，減少MMP-3和MMP-13的表達，來保護軟骨終板，延緩LIDD。這表明通過減弱分解代謝信號可以糾正SASP失衡，促進EPCs的去分化和再分化，糾正ECM降解和合成代謝之間的紊亂，從而促進椎間盤修復與再生，延緩LIDD進展。

5.激活自噬:自噬對軟骨終板和椎間盤的保護作用，與自噬參與調控EPCs代謝有關。研究表明，自噬激活可以增加EPCs中Ⅱ型膠原的分泌，抑制MMP-13分泌，從而發揮保護椎間盤的作用[30]。例如Yu等[31]研究發現，自噬相關基因微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3, LC3)和自噬效應蛋白1(beclin-1)的表達隨著終板軟骨細胞活性的降低而顯著降低，自噬活性可能與椎間盤的發育和退變有關。左睿等[32]在構建小鼠軟骨終板退變的模型上，發現氯喹抑制自噬時軟骨終板退變加重，而雷帕霉素激活自噬可以對EPCs起保護作用，其作用機制可能是通過激活核因子E2相關因子2和(或)胞質蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/the kelch-like ECH-associated protein 1,Nrf2/Keap-1)信號轉導，促進抗氧化蛋白表達，清除活性氧，減少EPCs衰老并維持其分化潛能來實現的。因此，通過激活EPCs內自噬水平來抑制軟骨終板退變可以為減輕椎間盤退變提供新的治療方向。

五、展 望

綜上所述，研究EPCs衰老機制對LIDD的預防和治療具有重要價值。EPCs衰老主要與DNA損傷、端粒縮短、氧化應激、SASP紊亂和自噬抑制等有關，通過減輕DNA損傷、激活端粒酶活性、抗氧化損傷、維持SASP穩態、激活細胞自噬等途徑可以減輕EPCs衰老，保護EPCs合成分泌蛋白功能，維持ECM合成分解代謝平衡，保護軟骨終板生理結構和功能，保障椎間盤的結構支撐和營養供應，從而延緩LIDD進程。通過保護EPCs來保護椎間盤的方法，可以為將來更成熟的細胞移植技術提供理論支撐，也為臨床上防治LIDD相關疾病提供了新的思路。只是目前大多數研究尚處于細胞模型和動物實驗階段，缺少人體實驗及臨床研究數據，尚不明確這些途徑是否能夠在促進EPCs增生的同時保護其功能正常。另外目前關EPCs衰老的研究方向也比較單一，例如涉及到相關通路抑制劑和激動劑的使用，多停留在單方向通路研究，而多通路抑制劑或激動劑聯合使用是否能發揮更好的作用，如何鎖定核心作用機制尚不明了，因此今后應在不斷完善分子機制研究的基礎上積極開展相關的臨床應用研究，去探尋更完善的治療靶點。