基于環介導等溫擴增的微流控技術在病原體檢測中的發展與應用

歐紅玲，王綺遠，王巖，張巧云，馬盈盈，白靜，康少平，王欣茹

(1.火箭軍特色醫學中心檢驗科，北京 100088； 2.河北北方學院醫學檢驗學院，河北 張家口 075000)

傳統的微生物培養法是病原體檢測的金標準，需要耗時3～5 d，涉及多種儀器和試劑，對人員的專業技能和經驗要求高。因此，縮短檢驗時間和減少實驗條件限制一直備受關注。近年來，利用分子生物學方法快速檢測病原體的技術取得了很大進展[1-4]，但檢測儀器(核酸擴增儀)昂貴，且對實驗室和人員的要求較高，操作程序復雜，檢測需要3～5 h，主要適用于大型醫療機構和專業實驗室。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術通過獨特的引物設計和鏈置換酶，可在恒溫條件下自動循環合成目標基因，這種技術擺脫了對熱循環聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀的依賴，降低了核酸檢測的復雜度，1 h內即可得到實驗結果。微型鑄造加工技術的發展促進了早期微流體的研究[5]，實現了微米空間通過流體對研究對象的分析。隨著加工技術的發展，微通道的設計可將微流體分隔成多個反應單元，用于多種病原體檢測[6]，可以保證各自反應的獨立性和結果的準確性。基于LAMP的微流體檢測技術發揮LAMP和微流控的優勢，檢測體系僅需要少量的樣本和試劑，操作程序簡單，不需要大型的昂貴儀器設備和專業技術人員，利用相機等成像設備或肉眼等即可觀察結果。目前，LAMP技術主要應用于食品安全和醫療檢測領域，在環境污染檢測[7]、刑事偵查[8]和檢驗檢疫[9]等方面廣泛應用。現對基于LAMP的微流控技術在病原體檢測中的發展與應用進行綜述。

1 基于LAMP的微流控技術

Notomi等[10]提出了一種新型等溫擴增方法，LAMP針對靶基因的6個區域設計4～6條特異引物，在恒定溫度下，利用鏈置換DNA聚合酶快速擴增目標基因的DNA或RNA，通過觀察添加的指示物顏色變化或產生的熒光信號強度達到檢測的目的。檢測過程不需要昂貴高精密的儀器，只需要一個恒溫箱就能實現目的基因的大量、高效擴增，與PCR技術相比，LAMP技術運行成本低、檢測時間短，且LAMP對目的基因有高度選擇性，能降低非靶序列的影響，具有較高特異性。微流控技術與LAMP結合提高了病原體檢測的效率，實現了快速、廉價、便捷的診斷分析[11-12]，芯片的密閉空間避免了LAMP潛在的氣溶膠污染[13]。

1.1基質材料的發展 微流控技術發展以來，科研人員一直致力于尋找合適的基質材料作為實驗進行的載體。玻璃類[14]、石墨烯[15]、聚二甲基硅氧烷[16]、聚甲基丙烯酸甲酯[17]等材料不斷被研究并用于制作微流控設備。早期微流體分析設備主要以玻璃、硅、石英或塑料等為基質材料，因成本高、制作方法比較復雜、重復使用易污染等限制了其大規模使用。2007年，紙質材料被應用到微流控技術中制作成紙質芯片[18]，由純纖維素制成的層析紙和濾紙，通過毛細管作用驅動液體，結合聚二甲基硅氧烷或石蠟等疏水材料，根據實驗需求設計制作成2D或3D微流控設備，完成病原體檢測。Cheng等[19]使用紙基微流控芯片檢測人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)和T7噬菌體，結果表明，紙基微流控芯片法較酶聯免疫吸附法和PCR法檢測快速且更經濟。王歡[20]將紙質微流體與LAMP結合構建可視化的病原體和耐藥基因檢測芯片。李尚陽等[21]將LAMP聯合橫向流動試紙條可視化檢測志賀氏菌。Meng等[22]通過基于聚二甲基硅氧烷材質的微流控芯片技術實現鑒別金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌的多重實時檢測，以mecA和femA基因為靶點預測對甲氧西林耐藥性，實驗結果與常規實驗一致。材料技術和工藝的不斷完善提高了LAMP與微流控技術在病原體檢測領域的效率，多項研究滿足多樣本、多菌種同步定性檢測及鑒定需求，顯示了強大的應用潛力。

1.2結果監測的發展 凝膠電泳法作為觀察LAMP結果的“金標準”[10,23]，能形成具有代表性的瀑布狀圖形，但無法在微型的微流控設備上實現，易造成實驗室污染，故多不采用凝膠電泳法對基于LAMP的微流控檢測結果進行判讀。目前，LAMP的結果觀察常用比色法，其操作簡單、對閱讀器要求較低，有時肉眼即可觀察結果。對于產生大量焦磷酸鎂白色沉淀的LAMP檢測陽性反應，可利用濁度儀對結果進行實時、定量檢測[24]，也可用肉眼進行結果判讀，但肉眼觀察結果時可因觀察者的主觀判斷差異產生誤差，特別是弱陽性結果，故可在此基礎上通過添加染料(羥基萘酚藍或鈣綠黃素等)使結果易于肉眼觀察，羥基萘酚藍不會抑制LAMP反應過程，故被廣泛使用[25]。

針對病原體檢測的最好方法是熒光信號檢測，熒光團極敏感，若以紙材料為基質制作微流控芯片，紙的美白劑會增加背景光，影響熒光信號的檢測，所以熒光檢測依賴于高質量的信號閱讀裝置，一般情況下基于熒光實時檢測的LAMP反應較濁度實時檢測的LAMP反應更快，且靈敏度更高，反應中不透明混合物(蛋白質和質粒)對實驗結果的影響更小，但檢測成本更高。

2 基于LAMP的微流控技術在病原體檢測方面的應用

病原體的快速準確檢測對流行病學分析和感染性疾病早期防控具有重要意義。基于LAMP的微流控技術為病原體即時檢驗提供了一種快速診斷方法，尤其適合于基層實驗室、災區救治、感染事件現場等極端條件下病原體的快速篩查和現場檢測。

2.1在呼吸道病原體監測中的應用 呼吸道病原體感染是呼吸系統的常見病，季節交替時更易發生，特別是流行性感冒病毒的易感人群，可能引起流行性感冒的爆發，基于LAMP的微流控技術特別適合于臨床病原體的快速診斷。趙溜[26]對呼吸道感染痰標本分別進行普通痰培養和常見呼吸道病原體的擴增分析(利用晶芯等溫擴增技術)，結果顯示，晶芯呼吸道病原體檢測較傳統痰培養的陽性率高，肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、嗜肺軍團菌和結核分枝桿菌復合群的病原體檢出結果一致，但肺炎鏈球菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的檢出率明顯高于傳統痰培養，有助于減少漏檢，對疾病進行更早的診斷和治療。李艷燕等[27]收集患者深部痰液標本進行呼吸道病原體檢測，LAMP微流控芯片的呼吸道病原體檢出總陽性率為58.27%(155/266)；而傳統分離培養法的呼吸道病原體檢出陽性率為35.8%(92/257)。可見，與傳統分離培養法相比，LAMP微流控芯片的呼吸道病原體檢出率高，檢測快速、高效且靈敏度高，可為臨床快速診斷和精準治療提供可靠依據。此外，LAMP微流控芯片檢測可一次快速檢出多種病原體，較傳統痰培養更具優勢，可更早地發現病原體感染，以早期抗感染治療，提高治療效果。

2.2在HIV檢測中的應用 目前，尚無治療HIV感染所致獲得性免疫缺陷綜合征的有效手段，僅可通過藥物緩解發病或控制癥狀，故HIV感染的早期診斷有助于患者早期治療。Damhorst等[28]使用微流控和硅芯片平臺對最小處理的HIV加標全血樣本進行逆轉錄LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)，并使用普通智能手機進行熒光測量，結果顯示，在～60 nl RT-LAMP液滴中，只有3種病毒擴增，相當于每微升全血中670種病毒的全血濃度，表明可通過手指穿刺血液確定HIV陽性個體的病毒載量。郭宏雄等[29]成功建立了LAMP檢測HIV-1 DNA的方法，該技術的靈敏度高達10拷貝/μl，檢出率高達84.3%，可檢測國內4種主要亞型CRF0AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B亞型HIV-1重組型，且特異性良好。Chen等[30]將LAMP和微流控芯片技術結合，成功實現了HIV RNA的卡式芯片提取和RT-LAMP檢測，大約20 min即可完成檢測，靈敏度較高，表明卡式RT-LAMP技術可成功實現HIV檢測，且該研究建立的微流控系統能夠檢測血液或唾液樣本中的宿主抗HIV抗體和病毒RNA，結果較免疫方法和分子方法更可靠。綜上，基于LAMP和微流控技術的優勢建立的檢測方法程序簡單，可實現標準化，適用于HIV感染的早期快速檢測及極端條件下的病原體早期篩查。

2.3在結核分枝桿菌檢測中的應用 結核病亦稱“癆病”，是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。近年來，受到流動人口增加、耐藥結核分枝桿菌蔓延、結核分枝桿菌與HIV雙重感染等客觀原因的影響，結核病的發病率和病死率升高。方雪恩[31]結合微流控芯片技術和LAMP建立了單個和多重定性定量的微流控集成芯片，整合基因的提取、擴增以及信號檢測，僅需要微量的原始樣品，即可在45～60 min內直接通過裸眼判定結核分枝桿菌。朱亞光等[32]采用LAMP芯片法和羅氏培養法對疑似關節結核患者的關節液或感染創口分泌混合液進行鑒定，結果顯示，LAMP芯片法的檢測陽性率明顯高于羅氏培養法，表明恒溫擴增微流控芯片檢測可作為關節結核的篩查實驗。2016年，世界衛生組織推薦LAMP法作為結核分枝桿菌DNA檢測項目，用于肺結核的診斷和鑒別診斷。因此，基于LAMP的結核檢測體系具有良好的引物設計和質量控制體系，可彌補痰涂片的不足，并擴展到其他病原體的快速床邊檢測，對急性傳染病的防控具有重要意義。

2.4在腦膜炎奈瑟菌檢測中的應用 腦膜炎奈瑟菌通過呼吸道傳播，是引發流行性腦膜炎的唯一病原菌。預防腦膜炎奈瑟菌感染的關鍵是盡早清除傳染源、早期診斷和治療，切斷傳播途徑。Dou等[33]自主研發的基于LAMP的聚二甲基硅氧烷/紙混合微流控芯片可實現對腦膜炎奈瑟菌的檢測，最低檢出限僅為3拷貝/LAMP反應區，靈敏度高。李海清等[34]針對腦膜炎奈瑟菌屬基因序列設計引物建立了基于LAMP的腦膜炎奈瑟菌快速檢測方法，并通過優化檢測系統，使其反應更加快速，其靈敏度為普通PCR法的10倍，適用于普通實驗室及即時檢驗，有助于提高檢測速度、縮短檢測時間、擺脫實驗設備和技術人員等條件的限制，為感染性疾病的早期診斷和治療提供有效可行的方法。

2.5在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)檢測中的應用 HBV感染是人類健康的世界性公共衛生問題之一。在HBV診療過程中，盡早發現早期低病毒血癥患者、將診療關口前移、及時干預，是目前臨床關注的問題。王可可等[35]利用基于PCR的微流控芯片成功完成了HBV核酸的快速檢測，Ct值約為37時，檢測結果為弱陽性，血液樣本檢出微量HBV，可早期發現HBV感染。郅曉[36]將設計制作的LAMP微流控集成芯片在恒溫63 ℃反應1 h后，成功完成HBV的基因分型檢測，該微流控芯片通道內反應發生時，微流控芯片標記探針的同一區域在注入磁性納米團簇前后發生磁場變化，被巨磁阻傳感器檢出，電阻變化顯示陰、陽信號變化，上述檢測體系集樣品的混合、核酸擴增以及信號采集等功能于一體，對電信號的檢測更靈敏，檢測范圍為10～109拷貝/ml，具有耗時短、特異性好、靈敏度高、抗干擾能力強等優點。高敏感的基于LAMP的HBV微流控檢測芯片的應用，可盡早發現低病毒血癥及隱匿性肝炎患者，降低漏檢的可能性，阻斷HBV感染的傳播。

2.6在新型冠狀病毒檢測中的應用 新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)的高效、準確、快速實驗室檢測是阻止疫情發展、確保患者盡早治療的關鍵環節。2020年11月17日，美國食品藥品管理局緊急發布使用授權，批準Lucira COVID-19一體化測試盒作為“新型冠狀病毒居家自檢測試劑盒”，該試劑盒利用RT-LAMP技術檢測SARS-CoV-2的N基因RNA，通過微流控裝置中光學和電子元件實時檢測反應混合物的顏色變化，30 min內實現新型冠狀病毒的快速診斷；采用羅氏COBA S-CoV-2試驗對101名懷疑有癥狀受試者的鼻拭子樣本進行差異分析，Lucira COVID-19一體化測試試劑盒與美國食品藥品管理局授權的高靈敏度分子SARS-CoV-2分析的陽性符合率為94.1%(48/51)，陰性符合率為98%(49/50)，體現了Lucira COVID-19一體化測試試劑盒的良好檢測性能[37]。NSF International和Novateur Ventures的研究人員在篩選了1 100多個獨立評估COVID-19的即時檢測測試后，推薦基于RT-LAMP原理的Seasun Biomaterials AQ-TOP Plus COVID-19 Rapid Test用于新型冠狀病毒急性感染的病毒RNA檢測[38]。Augustine等[39]通過分析發現，PCR的局限性包括實驗室、技術人員和從業法規制度的要求較高，以及結果等待時間較長、測試總費用高昂。這促使研究人員尋找快速、經濟且可執行的替代診斷方法。基于RT-LAMP檢測體系集成微流控載體為快速經濟高效診斷COVID-19提供可靠解決方案，特別是為發展中國家和低收入國家準確檢測低拷貝數核酸提供了可靠的替代平臺。值得注意的是，以紙條形式開發的基于RT-LAMP的診斷工具或將該方法集成到微流控平臺(如芯片實驗室)徹底改變了COVID-19診斷中即時檢驗的概念，體現了COVID-19診斷背景下RT-LAMP的應用前景。

3 小 結

微流控技術與LAMP的整合具有集成化和微型化的優勢，通過結合兩種技術建立快速檢測方法是當前的研究熱點，且其在病原體快速檢測方面的廣泛應用是未來的發展趨勢。微流控裝置制作工藝的日益成熟、反應系統性能的提高、人工操作的減少、自動化程度的提高均有助于提高檢測速度和通量，并實現檢測標準化。基于LAMP微流控芯片的檢測速度快、靈敏度高、特異性強，適用于即時檢驗[40]，特別適用于不具備病原體培養條件、缺乏病原體檢測設備及專業人員等情況下的病原體快速檢測，如現場野外、災區救治、基層醫療機構，既可降低成本，又可實現高質量的快速診斷，在病原體感染所致重大疾病的防控及公共衛生事件的處置中均有非常重要的現實意義。然而，目前建立的微流控反應體系在兼容樣本的核酸提取和多重擴增條件的一體化方面尚存在不足，隨著技術持續改進優化，基于LAMP的微流控技術將日益完善，未來有更加廣闊的應用前景。