選擇性多聚腺苷酸化在心血管疾病中的研究進展

李曉慶 黃菁菁 季軍 高偉 魯翔

選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)作為一種mRNA轉錄后水平的調控機制普遍存在于真核生物中。mRNA成熟的重要步驟之一即前體mRNA(pre-mRNA)在3′非編碼區(3′UTR)的多聚腺苷酸化位點進行核內剪切并添加一個多聚腺苷尾[poly (A)尾]。大多數人類基因在3′UTR具有一個以上的多聚腺苷酸化位點，這些位點的交替使用可生成具有不同3′UTR長度的mRNA異構體[1]。通過APA機制產生多種mRNA異構體的同時也改變了其3′UTR區含有的順式調控元件，因此可導致產物受到microRNA、RNA結合蛋白(RNA-binding protein，RBP)等不同反式作用因子的調控，如較長3′UTR的mRNA轉錄可能具有更多的miRNA和RBP的結合位點，促進mRNA的降解，進而影響mRNA的穩定性和翻譯效率。這些都在一定程度上增加了不同組織中遺傳信息從DNA傳遞至蛋白質的復雜性，使得生物體產生多種不同的生理病理功能[2]。

近些年來研究表明APA模式是具有組織特異性的，如大腦中的mRNA通常具有較長的3′UTR，而睪丸中的mRNA具有較短的3′UTR[3]。此外APA還參與了疾病的發生發展過程，如3′UTR在腫瘤發生和T細胞擴增過程中的增殖階段會縮短，而在分化和發育過程中會延長[4]。心血管疾病是包括一系列涉及心臟、血管(動脈、靜脈、微血管)的疾病，目前仍然是全世界最主要的死因之一。近些年APA在心血管疾病病理生理進程中的調控作用也被逐漸證實。一些研究發現，APA參與調控了包括心臟發育、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、心肌肥厚(cardiac hypertrophy，CH)和心力衰竭(heart failure，HF)等多種心血管疾病的病理生理過程。本文將從APA的調控因子和機制出發，試對其在心血管疾病中的作用進行綜述。

1 APA調控因子和機制

APA調控因子包括切割及多聚腺苷酸化特異因子(cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF)，切割激活因子(cleavage-stimulating factor，CstF)，RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase, RNAP Ⅱ)和RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBP)等。在mRNA轉錄延長的過程中，CPSF和CstF結合在RNAP Ⅱ上，促進mRNA 3′UTR的加工修飾[5]。CPSF復合體通過CPSF-30中的鋅指結構以及WDR33(WD repeat-containing protein 33)中N端富含賴氨酸/精氨酸的模體, 識別并結合于mRNA 3′端相對保守的多聚腺苷酸化信號位點AAUAAA[6]；同時，CstF復合物通過CstF-64亞基中的RRM結構域, 識別并結合在下游富含GU/U的DSE區。以上兩個過程共同參與了多聚腺苷酸化位點的選擇[7]。隨之，poly(A)信號(PAS)上游20 nt處的UGUA序列招募切割因子(cleavage factor，CF)，CF在PAS下游10～30 nt處進行切割，然后多聚腺苷酸化聚合酶(PAP)編碼poly(A)尾巴完成mRNA的多聚腺苷酸化[8]。

許多蛋白因子不僅作為選擇性剪切和多聚腺苷酸化的參與者，也作為調控因子參與到APA的調控機制中。例如，Nudt21編碼的切割因子CFIm25亞基能夠優先選擇遠端的PAS，然而當其表達下調時則會選擇近端的PAS，從而影響了APA事件的發生。同時CFIm25還能通過APA偶聯染色質信號的調節影響細胞的命運[9]。不同類型的PAP負責編碼poly(A)尾的同時，在PAS的選擇和基因表達方面也發揮了一定的作用[10]。多聚腺苷酸結合核蛋白1(PABPN1)作為多聚腺苷酸化中普遍存在的蛋白質，能夠作用于PAP并增強其編碼poly(A)尾的能力。同時PABPN1可以控制poly(A)尾的長度在250 nt以內，并且PABPN1會優先選擇作用于遠端的PAS。但是,如果下調PABPN1的表達，多聚腺苷酸化就會優先發生在較不經典的近端PAS[11]。此外,還有像CPEB1、Nova這樣的反式作用因子也可通過調控APA機制改變相應致病基因的3′UTR長度，從而參與到疾病的發展過程中[12]。

2 APA在心血管系統中的研究

2.1 APA與心臟發育 心臟是胎兒體內第一個有功能的器官, 心臟發育是一個復雜的形態發生過程，它同時受到遺傳和表觀遺傳機制的調控, 但遺傳學已不足以解釋心臟發育的病理生理進程[13]。近些年來，越來越多的研究證實APA機制在心臟發育進程中發揮重要作用。Blech-Hermoni等[14]發現CELF1(CUG-BP, Elav-like family member 1)是一種高度保守的RNA結合蛋白，調節pre-mRNA的選擇性剪接、聚腺苷化、mRNA穩定性和翻譯。在心臟中，CELF1在心肌中表達，其水平在發育過程中受到嚴格調控，且在胚胎發生期間CELF1表達水平在心肌中達到峰值，這提示了CELF1通過APA機制在心臟發育進程中發揮重要作用。Qian等[15]的研究發現心臟轉錄因子Nkx2-5可以抑制miR-1的表達水平，而miR-1負調控心臟發育相關蛋白Cdc42的表達水平，因此Cdc42與Nkx2-5對心臟發育有協同作用。Nimura等[16]的研究進一步發現在心臟發育進程中，同源蛋白Nkx2-5和5′-3′外切酶Xrn2通過參與APA的調節發揮獨特的作用。Nkx2-5通過將Xrn2招募到靶向基因區域來調控APA, Xrn2具有5′-3′核酸外切酶活性并有助于基因末端的轉錄終止。Xrn2與mRNA抑制因子結合到轉錄起始位點(transcription start sites, TSSs)和其他下游區域，并參與RNAP Ⅱ延伸的調控。Nkx2-5缺失影響Xrn2與靶基因位點的結合，這不僅可以導致RNAPⅡ的占用增加，而且可以促進心臟發育相關基因長3′ UTR的mRNA表達增加[17]。APA調控過程還可以促進機體產生必要數量的心肌蛋白，例如由Tnnt2和Atp2a2編碼的心肌肌鈣蛋白T(cTnT)。cTnT的組成部分是肌節組裝所必需的，對維持正常的心臟功能至關重要，這也間接提示了APA機制對心臟發育的重要作用[18]。

2.2 APA與AS AS是一種緩慢的、進行性的心血管疾病，其中炎癥反應在AS斑塊形成以及斑塊不穩定過程中起重要作用。由于NLRP3炎癥小體可誘導促炎細胞因子IL-1β和IL-18產生，從而成為AS等許多常見炎癥性疾病的有力驅動因素[19]。Tristetraprolin(TTP)是鋅指蛋白36同源物，具有抗炎、抗腫瘤的作用，其表達減少會加劇AS的進展[20]。2017年，Haneklaus等[21]發現調節NLRP3表達的新的轉錄后機制，NLRP3基因轉錄后可通過APA生成兩種mRNA轉錄本(一種3′UTR約為600 bp，另一種約為300 bp)，并且短3′UTR的穩定性優于長3′UTR。接著，他們經過實驗發現了TTP通過結合于長3′UTR上富含AU的序列(AU-rich elements, ARE)，可以抑制NLRP3炎性小體的表達，提示APA機制在AS進程中具有重要的作用。

2.3 APA與CH CH的病理特征是心臟前后負荷的增加導致心肌細胞增大，隨著壓力負荷的持續，最初的適應性肥大反應是有益的，因為它可以維持心臟正常的功能，然而持續的心肌細胞功能障礙會導致心肌收縮力受損，引起不可逆的心臟結構重塑[22]。有研究表明，編碼“促肥大”和“抗肥大”蛋白的各種基因可以通過改變其mRNA 的3′UTR來調控自身的蛋白表達水平。APA模式發生的變化會影響3′UTR區的長度，從而改變心臟肥大過程中幾種蛋白調節劑的表達[23-24]，如NAD(P)H: 醌氧化還原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]，非規范性聚合酶(speckle targeted PIPKIαregulated poly(A)polymerase，Star-PAP]，RNA結合基序蛋白10(RNA binding motif protein 10，RBM10)等。

Kumar等[25]發現NQO1負責編碼NQO1蛋白，其作為一種抗氧化酶在心肌細胞的保護中起著重要的作用，并且NQO1表達的改變也參與了CH的病理進程。Star-PAP作為一種特異性poly(A)聚合酶，通過對poly(A)位置的選擇參與了APA調控，其敲除后會導致3′UTR的縮短或延長。Kandala等[26]發現Star-PAP可以與多聚腺苷酸化聚合酶α(PAPα)競爭結合CPSF-160，但Star-PAP的競爭性更強，更容易與CPSF-160形成復合物，并結合于CH相關基因NQO1的特殊poly(A)位點，進而介導APA調控其表達，從而參與CH的進程。Star-PAP的優勢不僅僅在于和CPSF-160的結合，還在于：靶mRNA 3′UTR的PAS上游有一段-AUA-模體以及富含GC的序列，這樣的順式作用元件能夠被Star-PAP特異性識別，使其搶占poly(A)位點；靶mRNA 3′UTR的PAS下游的DSE段U含量低，能夠阻礙CstF-64的識別與結合，而Star-PAP發揮作用并不需要CstF-64。總而言之，Star-PAP通過識別靶基因的特定poly(A)結合位點，介導APA參與調控的CH。研究發現，RBM10作為一種RNA結合蛋白和RNA剪接因子，可在一定程度上協助Star-PAP的功能以調節CH涉及的關鍵基因。RBM10上的RRM2結構域能夠與Star-PAP催化結構域結合形成復合物，并結合于mRNA的 3′UTR上，并通過APA事件調控“抗肥大”調節因子的表達。有研究證明，不能與Star-PAP結合的RBM10缺失突變體(RRM2結構域缺失)不能挽救異丙腎上腺素治療引起的細胞肥大和相關分子事件，這說明RBM10作為一種重要的“抗肥大”調控因子能夠與Star-PAP協同抑制心臟肥大[27]。

2.4 APA與HF HF是心血管疾病的主要表現形式，也是很多心血管疾病的終末狀態。HF伴隨著心臟內穩態的丟失，這依賴于基因表達的嚴格調控。APA通過對HF靶基因mRNA 3′UTR的長度進行調控從而參與HF的病理進程，有研究發現衰竭的心臟中基因3′端mRNA的形成發生了變化，但其對于致病的重要性仍然未知。2016年Creemers等[28]使用3′端RNA測序(e3′-Seq)直接測量人類健康和衰竭的心臟標本中APA的整體模式。通過監測這些心臟中的多聚腺苷酸化譜，在眾多基因中鑒定了疾病的特異性APA信號，同時該研究還發現許多HF相關基因的3′UTR會相應發生縮短，并且這些基因的作用大多與RNA結合相關，但是3′UTR延長的基因則與細胞骨架以及肌動蛋白結合相關。在更大范圍的人類心臟中進行的RNA測序表明，這些可能和APA機制相關的基因通常在衰竭的心臟中差異表達，并且3′UTR的長度與基因表達水平之間呈負相關。他們的研究還發現：在衰竭心臟中，APA調節蛋白PABPN1表達量顯著下調，提示PABPN1的下調可能與某些基因使用近端PAS有關。該研究還觀察到了CPSF-4表達下調和斷裂和聚腺苷酸化因子亞基(cleavage and polyadenylation factor subunit-11， PCF11)表達上調，提示這些APA調控因子在心臟衰竭的進程中起到了潛在作用。但是在衰竭心臟中3′UTR的延長機制還不清楚，有待于后續的實驗研究。

3 總結

半數以上的人類基因存在潛在的APA位點，APA的調控影響多種基因的生物學功能，在多種疾病的發生發展中發揮重要作用。近些年來APA在心血管系統中的重要作用逐漸被證實，發現APA在心臟發育、AS、CH和HF等中通過調節mRNA的3′UTR 長度調控相關基因的穩定性和翻譯效率，進而調控相關蛋白的表達水平。因此深入研究APA在心血管系統中的調控機制可能有助于尋找心血管系統疾病的潛在治療靶點，為尋找更為有效的治療提供理論依據。