宏基因組學第二代測序技術對比傳統微生物培養在慢性子宮內膜炎病原學診斷中的優勢

劉海瑛 譚國英 李愛平

（青島市婦女兒童醫院生殖中心，青島市黃島區中醫院，山東 青島 266000）

慢性子宮內膜炎一般無經典的臨床癥狀，多是 由急性炎癥轉變而來，是由于各種原因引起的子宮內膜結構發生炎癥性的改變，細菌可通過陰道上行至宮頸，造成子宮內膜、輸卵管的感染[1]。有文獻顯示，慢性子宮內膜炎是造成女性不孕不育的主要原因之一[2-3]。在輔助生殖技術的研究中，發現慢性子宮內膜炎會影響患者的胚胎著床率、胚胎發育率，且易造成復發性流產、著床反復失敗。Puente等[4]研究顯示，與健康人群相比，罹患子宮內膜炎的患者流產率、胚胎著床率都較高。慢性子宮內膜炎的主要病理特征是：子宮內膜間質的漿細胞浸潤，因此，子宮內膜微生物檢測能為慢性子宮內膜炎患者的診斷、治療提供可靠的臨床信息。目前，子宮內膜微生物檢測方法仍以傳統的微生物培養法為主，但該方法對技術要求高、耗時長，且多數微生物無法通過培養法來鑒定，因此，在臨床的應用中受限。而非培養的新型診斷技術——宏基因組學第二代測序技術（metagenomic next generation sequencing，mNGS）迅速發展起來，在病原學診斷方面具有獨特的優勢，具有檢測時間短、操作簡便、檢測準確率高等優點[5-6]。本研究采用mNGS法來檢測慢性子宮內膜炎患者的病原體，并與傳統微生物培養法相比較，評價mNGS法在慢性子宮內膜炎病原學診斷中的優勢。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2021年12月我院生殖中心病理及宮腔鏡檢查初步診斷為CE的不孕不育患者500例，患者年齡23～40歲，平均（31.38±4.79）歲。納入標準：①患者年齡大于18歲，臨床病理證實為慢性子宮內膜炎。②對同一位置的標本同時進行微生物培養法與mNGS的檢測。③子宮內膜標本采集前1個月內均不曾使用任何抗生素。排除標本在取樣、轉運、處理過程中受到污染者。同時取子宮內膜標本送檢，每份標本均分為2份，1份行傳統微生物培養法檢測病原體，另1份行mNGS法檢測病原體。所有患者知情、同意并簽署相關文件，本研究已獲得我院倫理委員會的批準。

1.2 標本采集

1.2.1 宮腔鏡檢查時子宮內膜活組織取樣 女性在月經期干凈后，完善檢查無陰道炎、無手術禁忌證，術前清洗外陰，消毒陰道、宮頸，放置內窺器，再次碘伏消毒宮頸口、陰道側壁，生理鹽水擦洗宮頸口，進鏡鏡下對子宮內膜充血、微小息肉等可疑感染組織活檢鉗取樣，一份密封送病原體培養，一份基因測序標本置細胞保存液，2～8 ℃保存送至實驗室。

1.2.2 小刮匙取宮腔內膜標本 術前清洗外陰，消毒陰道宮頸，放置內窺器，再次碘伏消毒宮頸口、陰道側壁，生理鹽水擦洗宮頸口，小刮匙進行內膜取樣，所獲標本密封保存2份備檢。1份密封送病原體培養，1份基因測序標本置細胞保存液，2～8 ℃保存送至實驗室。

1.3 微生物培養 標本分別接種在巧克力瓊脂平板、麥康凱平板和哥倫比亞血瓊脂平板、沙保羅平板，并分區劃線接種，部分于35 ℃、5%二氧化碳培養箱中進行需氧培養，部分置厭氧箱無氧培養，培養時間為72 h。

1.4 宏基因組學第二代測序

1.4.1 DNA提取：標本超聲破碎后，按照試劑盒步驟提取DNA。

1.4.2 文庫構建和測序 采用 Agilent2100Bioana-Lyzer質控文庫插入DNA片段，按操作說明調整DNA文庫濃度，然后經環化形成單鏈環形結構。環化文庫經滾環復制生成的DNA納米球，加載到測序芯片，使用 Bio-electronseq4000測序。測序數據去除低質量、長度小于35bp、人參考基因組序列。行微生物大數據庫比對，并將比對后的數據按病毒、細菌（需氧菌、厭氧菌分類）、真菌、支原體、衣原體等分類排列。

1.5 慢性子宮內膜炎的治療 應根據慢性子宮內膜炎病原體微生物的檢測結果進行治療。如革蘭陽性球菌應用阿莫西林克拉維酸鉀治療，革蘭陰性桿菌應用左氧氟沙星治療，支原體、衣原體感染應用阿奇霉素治療，厭氧菌應用替硝唑治療，多種致病菌復合存在時聯合用藥或用多西環素治療；針對宮腔鏡檢查及內膜病理提示內膜炎征象者，要按相應菌群抗感染的同時進行中醫辨證論治2周，次月陰道放置陰道用乳桿菌活菌膠囊（商品名：定君生）治療2周。

1.6 復查 療程結束后于下月月經干凈后3～7 d，取標本再次細菌培養及mNGS，提取原檢測微生物DNA，檢測治療后微生物變化情況。

1.7 觀察指標 首先，分析治療前子宮內膜標本微生物培養法與mNGS法檢測出的病原體的數量及種類、微生物檢出陽性率；其次，對兩組檢測結果的一致性進行分析；第三，經過后續治療后，對兩種方法檢測出的病原體復檢陽性率進行比較；第四，評價mNGS對慢性子宮內膜炎的診斷價值。

1.8 統計學處理 數據分析統計軟件使用SPSS21.0，計數數據對比采用χ2檢驗，用（n，%）表示，當P＜0.05提示數據差異有顯著性。

2 結果

2.1 治療前兩種方法檢測出的病原體數量及種類、微生物檢出陽性率比較 傳統微生物培養法的檢出陽性率為20.80%（104/500）；mNGS法的檢出陽性率為79.40%（397/500），有顯著性差異（P＜0.05）。通過傳統微生物培養法共檢出104例，致病菌包括：肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌、糞腸球菌等。通過mGNS法共檢出397例，除上述致病菌外，還檢測出了細菌[陰道加德納菌1例、金黃色葡萄球菌1例（圖1）]、病毒（巨細胞病毒1例、乳頭狀瘤病毒1例）、支原體[解脲脲原體2例（圖2）。

圖1 mNGS檢測出子宮內膜金黃色葡萄球菌感染結果

圖2 mNGS檢測出子宮內膜解脲脲原體感染結果

2.2 兩種方法檢測結果的一致性 在500例子宮內膜標本中，兩組檢測結果完全不一致的有105例（21.00%），檢測結果不完全一致的有241例（48.20%），檢測結果完全一致的有154例（3.00%）。

2.3 治療后兩種方法的復檢陽性率比較 傳統微生物培養法復檢陽性率為13.46%（14/104），mNGS法復檢陽性率為15.87%（63/397），可見，經治療后mNGS法的轉陰率顯著高于傳統微生物培養法，有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 mNGS的診斷價值 以培養結果為金標準，mNGS的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為85.39%、58.92%、68.47%、61.09%。

3 討論

微生物感染是誘導子宮內膜的炎癥與氧化應激反應的重要介質[7]。既往有學者發現，慢性子宮內膜炎患者中有多種類型的病原體，細胞、病毒、支原體、衣原體等，共同參與了子宮內膜炎的發生發展過程[8]。因此，微生物侵襲是誘發子宮內膜炎癥的常見病因[9-10]。由于微生物的特性，再加上藥物的耐藥性，子宮內膜炎患者的治療應該依據不同的病原體進行個體化的治療。抗菌藥物的盲目大量使用會加重菌群的失調、微生物的耐藥性，不利于患者胚胎的著床、發育。因此，快速、有效、可靠的檢測出患者宮腔內的致病微生物，對后續的治療以及預后都有著重大意義。mNGS法的檢測覆蓋范圍很廣，細菌、病毒、支原體等都能被檢測出來，且敏感度很高。目前mNGS法主要是針對呼吸道、腦脊液、血液等部位檢測，目前在病原體中檢測的相關研究還比較少見。因此，本研究旨在通過對比宏基因組學第二代測序技術（mNGS）與傳統微生物培養在慢性子宮內膜炎病原學檢測結果的差異，評價mNGS在慢性子宮內膜炎病原學診斷中的優勢。

mNGS法在慢性子宮內膜炎病原體檢測中具有很高的敏感度，覆蓋率很廣。因此，我們對mNGS法的優勢進行了總結，包括以下幾點：①mNGS法具有更高的敏感度[11-14]。本研究中兩種檢測方法一致性的結果顯示，傳統微生物培養法有105例為陰性，而mNGS法檢測出為陽性。既往認為，傳統微生物培養法是血液感染金標準，但對微生物陽性率的檢出率則受采血時間、采血量、培養次數等諸多因素的影響，即使有感染也未必會分離出細菌，因此傳統微生物培養法檢測為陰性也并不能排除感染的可能性。有文獻顯示，血傳統微生物培養法的敏感度僅有40.00%[15]。因此，有必要對有懷疑的子宮內膜炎患者進行mNGS法檢測[16-17]。本研究結果顯示，在500例子宮內膜標本中，兩組檢測結果完全不一致的有105例（21.00%），檢測結果不完全一致的有241例（48.20%），檢測結果完全一致的有154例（3.00%）。經治療后mNGS法的轉陰率顯著高于傳統微生物培養法（P＜0.05）。以培養結果為金標準，mNGS法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為85.39%、58.92%、68.47%、61.09%。②mNGS法對少見菌的檢測具有優勢。厭氧菌對取樣、標本培養的條件要求很高，且病毒只能在活細胞中才可以生長繁殖。在理論上講，mNGS法并不依賴于培養，因此可以檢測出并未檢測出來的病原體。本研究結果顯示，mNGS法的檢出陽性率明顯高于傳統微生物培養法，有顯著性差異。對兩種方法檢出的微生物類型進行比較，發現通過傳統微生物培養法僅發現了一些致病菌，如肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌、糞腸球菌等。而mGNS法除了上述致病菌外，還檢測出了細菌（陰道加德納菌1例、金黃色葡萄球菌1例）、病毒（巨細胞病毒1例、乳頭狀瘤病毒1例）、支原體（解脲脲原體2例）。充分體現了mGNS法能夠發現一些少見的、平時難以發現的病原體[18-20]。

綜上所述，與傳統微生物培養法相比，mNGS法具有更高的敏感度，能檢測出更多的病原體。在慢性子宮內膜炎患者的治療中能精準的指導抗生素的應用。